人类免疫缺陷病毒(HIV-1)感染已造成世界范围内数千万人致病甚至死亡,严重威胁着人类健康。发展能预防和阻断HIV-1感染的疫苗一直是HIV-1研究的核心科学问题。然而,HIV-1极易发生突变并可通过多种方式逃避机体的免疫系统;同时,HIV-1亚型众多,不同地域的人群感染的HIV-1亚型具有不同的流行特点,不同人种的HLA限制性也相差甚远,这些因素都使得HIV-1疫苗的研发困难重重。迄今为止,国内外已经开展了大量HIV-1疫苗相关研究并取得一定的进展,但仍未研发出一种安全、有效的疫苗。因此,仍然需要采取不同的发展策略进行HIV-1疫苗的深入研究。本研究针对中国大陆地区病毒亚型的流行特点以及中国人群HLA限制性特征,开展以表位为基础的疫苗设计研究,着眼于设计发展一种中国人群适用的HIV-1候选疫苗。本研究拟通过生物信息分析技术,筛选在HIV-1中国主要流行病毒株中序列高度保守而且符合中国人群优势MHC限制性的表位;进行多表位疫苗的优化设计和构建;利用多个不同品系的小鼠模型进行疫苗免疫效果评价;并结合HIV-1临床感染者的细胞标本评价HIV-1多表位疫苗的人群适用性及在HIV-1预防和治疗方面的应用潜力。1.具有中国人MHC限制性特征的HIV-1表位筛选及多表位疫苗设计(1)候选表位的筛选及鉴定:为了筛选获得理想的表位用于疫苗设计,通过文献调研及数据库分析,筛选符合下列要求的表位:1)、表位位于env、gag及pol基因编码的蛋白上;2)、表位在中国主要流行株(China B、CRF01_AE、CRF07_BC及CRF08_BC)中高度保守;3)、表位的MHC限制性与中国人群优势分布的HLA基因型一致。利用软件分析表位的MHC限制性及序列保守性,最终获得9个符合条件的CTL表位,分别位于Gag(6个)、Env(2个)及Pol(1个)蛋白上,并选取了一段位于Env蛋白上的由36个氨基酸组成的Th表位富集区。(2)多表位核酸疫苗的优化设计、构建及鉴定:为了获得多表位疫苗的最优化设计,以上述筛选获得的九个CTL表位及一段Th表位富集区为基础,通过调整表位的串联顺序和呈现方式以及选用不同类型的表位间连接子,尝试多种多表位设计组合,并选择3个具有代表性的疫苗设计组合(MEG1、MEG2、MEG3),构建相应的真核表达质粒。通过生物软件分析三种设计的序列结构特征,通过细胞转染检测三种质粒的体外表达能力,通过动物实验评价三种质粒的体内免疫原性。结果表明,p JW4303-MEG1与p JW4303-MEG2序列特征相似,均在体外正常表达并在体内诱导产生特异性免疫反应;而p JW4303-MEG3不但其预测分析的结构特征与前两者显著不同,而且体外转染结果及体内免疫学检测结果均呈阴性。上述结果说明连接子的种类是多表位疫苗设计的主要影响因素之一,以柔性连接子“GGGS”的效果更优。(3)多表位核酸疫苗p JW4303-MEG1的免疫原性分析及保护效果评价:为了评价核酸疫苗p JW4303-MEG1的免疫效果,以BALB/c小鼠为对象进行核酸免疫,评价该候选疫苗诱导的单肽特异性免疫反应及免疫记忆。结果表明该质粒能有效诱导小鼠产生针对所有H-2d限制性表位的单肽免疫反应,诱导的长期免疫记忆能维持至少一年。进一步以重组病毒r TTV-lucgag进行小鼠攻毒,通过检测小鼠体内病毒嗜性组织的荧光素酶活性强度评价p JW4303-MEG1的免疫保护效果,结果表明免疫组小鼠体内的病毒含量与对照组相比虽然没有统计学差异,但病毒含量有明显的下降趋势。上述结果说明MEG1多表位疫苗设计策略为优化的疫苗设计方案,对应的核酸疫苗p JW4303-MEG1具有良好的免疫原性。2.HIV-1多表位蛋白疫苗MEP1在BALB/c小鼠体内的免疫学评价(1)多表位蛋白疫苗MEP1的制备及鉴定:为了制备获得高纯度的多表位候选蛋白疫苗MEP1,首先将大肠杆菌密码子优化的多表位序列插入到原核表达载体p QE30上构建重组表达质粒p E30-MEG1并酶切鉴定;小量诱导摸索最适诱导条件并鉴定,目的蛋白MEP1主要以包涵体形式表达;大量诱导制备获得含有MEP1蛋白的包涵体,8M脲溶解后利用Ni+柱亲和层析法纯化并进一步复性浓缩;利用SDS-PAGE及WB检测蛋白的纯度及特异性,最终成功制备高纯度的目的蛋白MEP1,可用于后续实验。(2)蛋白MEP1在BALB/c雌性小鼠体内的免疫学特征评价:为了评价重组蛋白MEP1诱导的免疫反应水平和免疫保护效果,以BALB/c雌性小鼠为对象,三次免疫后检测免疫反应并开展攻毒保护实验。ELISA结果表明MEP1能诱导高水平的特异性抗体;ELISPOT结果表明MEP1与铝盐佐剂联合免疫能有效诱导Th1/Th2平衡的细胞免疫应答及单肽特异性免疫反应;攻毒实验结果表明重组蛋白MEP1诱导的免疫反应具有一定的保护效果,能有效降低小鼠卵巢中的模式病毒r TTV-lucgag的含量。另外,该重组蛋白可快速诱导机体产生免疫应答,小鼠单次免疫后10天即可产生特异性细胞免疫反应。(3)小鼠性别对重组蛋白MEP1诱导的免疫反应的影响分析:为了评价性别因素对蛋白MEP1诱导免疫反应的影响。以BALB/c雄性小鼠为对象,进行蛋白免疫并进行免疫评价。结果表明,蛋白MEP1在雄性小鼠体内也能有效诱导体液免疫和细胞免疫产生。与雌性小鼠的免疫应答水平相比,雄性小鼠产生的抗体滴度和Th2型细胞免疫应答水平略低,Th1型细胞免疫应答水平则与雌性小鼠相当。蛋白在雄性小鼠体内同样具有抗病毒r TTV-lucgag效果,说明重组蛋白MEP1对不同性别的小鼠均可诱导有效的保护性免疫应答。3.HIV-1多表位蛋白疫苗MEP1诱导的人MHC限制性免疫反应特征研究(1)蛋白MEP1在转基因小鼠体内的免疫应答特征研究:为了验证蛋白MEP1诱导的细胞免疫应答与表位MHC限制性之间的相关性,以A2/DR1及A11/DR1转基因小鼠为对象并以基因本底C57BL/6小鼠为对照,蛋白联合铝盐佐剂免疫三次后进行免疫评价。ELISPOT实验及流式细胞术分析结果均表明蛋白诱导的细胞免疫应答与MHC限制性有显著关联,转基因小鼠产生的免疫反应强度及单肽特异性反应广度均显著优于C57BL/6对照小鼠。进一步以A2/DR1小鼠为对象检测蛋白免疫对小鼠免疫系统产生的影响,流式细胞术分析结果表明重组蛋白能改变机体的免疫细胞构成比并上调APC细胞表面的MHC-II类分子的表达,进而影响细胞免疫反应。(2)蛋白MEP1对HIV-1感染者PBMCs的体外刺激效果评价:为了进一步验证蛋白MEP1诱导的免疫反应与MHC限制性的相关性,并探索该蛋白在中国人群中的适用性,以HIV-1确诊感染者的PBMCs样本为对象,进行蛋白MEP1体外刺激。ELISPOT结果显示HIV-1感染者的PBMCs在蛋白刺激后能显著分泌细胞因子IFN-γ及IL-2,而正常人的PBMCs在蛋白刺激后则表现为阴性反应。后续分析结果表明,重组蛋白MEP1作用于不同MHC限制性人群和不同治疗阶段的病人,均能有效诱导细胞免疫,预示该多表位蛋白疫苗在中国人群中适应性好。4.结论本研究筛选获得了符合中国人群优势MHC限制性并在HIV-1中国主要流行株中高度保守的9个CTL表位和一段Th表位富集区。以此为基础开展HIV-1多表位候选疫苗的优化设计,实验研究发现,表位间连接子是多表位疫苗设计中的关键影响因素之一。本研究设计和发展了一种HIV-1候选多表位蛋白疫苗MEP1,该蛋白在小鼠模型中表现出良好的免疫原性和免疫保护性,并且能有效刺激HIV-1感染者的PBMCs产生免疫反应。该蛋白诱导的免疫反应与MHC限制性密切相关并且在中国人群中适用性好。本研究不仅为研发安全有效的HIV-1疫苗提供了新思路,同时也建立了一套系统的表位疫苗设计及评价体系,为其他病原疫苗设计提供了参考。