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从柏树枝中分离到一株内共生真菌NK-36b,其发酵产物经过TLC法初步鉴定,与紫杉醇标准品具有相同的迁移率(Rf值);经HPLC定性定量检测,与紫杉醇标准品具有相同的保留时间;经质谱进一步确定,与紫杉醇标准品具有相同的分子量;紫杉醇单克隆抗体实验呈阳性反应。
对NK-36b进行形态学鉴定,后根据真菌18S rDNA通用引物,以此菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增,扩增后的产物为1770 bp,测序结果初步鉴定到属;PCR扩增出该菌的rDNA基因间隔区ITS,该菌ITS序列长579 bp,测序结果进一步鉴定该菌株到种。
绘制NK-36b的生长曲线及紫杉醇生产曲线。在200 rpm,28℃条件下,PDA液体培养基中,连续培养6 d该菌生长最旺盛,菌丝产量最高;3 d就开始产生紫杉醇,10 d产量最高,平均产量是1 mg/L培养基。
为了便于在NK-36b中进行基因操作,建立了该菌的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的高效转化体系及原生质体转化体系。优化了原生质体实验条件及步骤,采用8 mg/ml蜗牛酶,1 mg/ml纤维素酶,以0.7 MNaCl为消化缓冲液,35℃静置消化1.5 h,纱布过滤,可得到106~108/ml的原生质体。原生质体与质粒DNA冰上共浴30 min,以60%的PEG3350介导转化,得到的转化子最多。继代培养转化子确定转化子的遗传稳定性,结果表明插入标记基因在无选择压力条件下培养8代仍稳定。
实验表明,NK-36b在羧甲基纤维素钠培养基上可以生长,在刚果红培养基上可产生水解圈,说明该菌可以降解纤维素。Bavendamm变色反应说明NK-36b不降解木质素,用上述试验筛选出一株既可以降解纤维素,又可以降解木质素的真菌NK-07c。