来源于肿瘤细胞或者病毒感染细胞的自噬小体在肿瘤及病毒抗原的交叉递呈过程中发挥了重要作用[1]。采用专利技术从转染HBV的细胞HepG2.2.15中提取的自噬小体类疫苗即DRibbles(HBV+)疫苗，含有丰富的HBV抗原组分，其双层膜结构特点也大大地增强其被抗原提呈细胞摄取的可能。　　Chen等[2]建立的HBV持续感染FVB/N小鼠模型，其HBV抗原可高水平维持50周以上，是理想的模拟HBV慢性感染的小鼠模型。本研究拟采用该模型探讨DRibbles(HBV+)疫苗对HBV感染的治疗作用。　　目的:　　以DRibbles(HBV+)疫苗作为治疗性疫苗，以持续感染HBV的FVB/N小鼠为动物模型，探讨DRibbles(HBV+)疫苗对HBV急性与慢性感染的治疗作用及其增强策略。　　方法:　　1.HBV感染小鼠模型的建立及DRibbles(HBV+)疫苗诱导野生型小鼠产生免疫应答的实验研究　　1.1尾静脉高压注射法注射pGEM4Z/HBV1.3质粒于FVB/N小鼠和Balb/c小鼠，ELISA法定期检测血清中HBeAg水平，免疫组织化学染色法分析肝脏细胞HBcAg表达，以监测HBV感染情况;　　1.2选取野生型FVB/N小鼠，淋巴结注射30μg DRibbles(HBV+)疫苗进行初免，3天后肌肉注射混有1mg纳米铝佐剂和30μg DRibbles(HBV+)疫苗的100μl PBS悬液进行加强免疫，3天后再以同样方法加强一次。并以PBS与无HBV抗原的DRibbles(HBV-)免疫小鼠作为对照。末次免疫后第7天取脾脏淋巴细胞并以HBsAg190-197和HBcAg129-140抗原肽体外刺激48h，ELISA法测上清IFN-γ含量。　　2.DRibbles(HBV+)疫苗治疗HBV急性感染的实验研究　　2.1于FVB/N小鼠感染HBV第5天，按照前述淋巴结注射进行淋巴结初免后2次肌肉注射再加强的治疗方法进行DRibbles(HBV+)疫苗免疫，同时以PBS与DRibbles(HBV-)免疫治疗作为对照。定期检测血清中HBeAg、ALT;　　2.2第18天取脾脏淋巴细胞加入HBsAg190-197和HBcAg129-140抗原肽体外刺激48h， ELISA法检测上清中IFN-γ含量;　　2.3第32天取肝脏组织，免疫组化技术分析HBcAg+肝细胞的比例，HE染色分析肝脏病理变化。　　3.DRibbles(HBV+)疫苗治疗HBV慢性感染的实验研究　　3.1于FVB/N小鼠感染HBV第8周，参照前述方法实施DRibbles(HBV+)疫苗免疫治疗，同时以PBS与DRibbles(HBV-)免疫治疗作为对照。定期检测血清中HBeAg水平;　　3.2第10周取脾脏淋巴细胞加入HBsAg190-197和HBcAg129-140抗原肽体外刺激48h，ELISA法检测上清中IFN-γ含量。　　4.DRibbles((HBV+)疫苗联合B/DRibbles(HBV+)治疗HBV慢性感染的研究　　4.1 FVB/N小鼠感染HBV第8周时，淋巴结注射DRibbles(HBV+)疫苗进行初次免疫治疗，并以PBS与DRibbles(HBV-)免疫治疗作为对照。3天后，尾静脉注射法进行B细胞负载DRibbles疫苗的加强治疗。定期检测血清中HBeAg水平;　　4.2第10周取脾脏淋巴细胞加入HBsAg190-197和HBcAg129-140抗原肽体外刺激48h，ELISA法检测上清中IFN-γ含量。第12周取肝脏组织，免疫组化技术分析HBcAg+肝细胞的比例。　　5.DRibbles(HBV+)疫苗联合PD-1、CTLA-4封闭性抗体治疗HBV慢性感染的研究　　5.1 FVB/N小鼠感染HBV第7周时，检测小鼠血清HBeAg水平并随机分为4组:①PBS对照组;②DRibbles(HBV+)治疗组;③αPD-1、αCTLA-4治疗组;④DRibbles(HBV+)联合αPD-1、αCTLA-4治疗组。参照前述方法于第8周对②④组小鼠进行DRibbles(HBV+)疫苗3次治疗。于治疗期一段时间内对③④组小鼠腹腔注射αPD-1(200μg/只)和αCTLA-4（100μg/只）。定期检测血清中HBeAg、ALT;　　5.2第10周时取各组小鼠脾脏淋巴细胞体外加抗原肽刺激48h，ELISA法检测上清中IFN-γ含量;　　5.3第12周取各组小鼠肝脏组织，免疫组化法分析其中HBcAg+肝细胞的比例，HE染色分析肝脏病理变化。　　结果:　　1.HBV感染小鼠模型的建立及DRibbles(HBV+)疫苗诱导野生型小鼠产生免疫应答的　　实验研究　　1.1 FVB/N小鼠血清HBeAg水平能够持续存在18周，7只小鼠中有2只出现降低。而Balb/c对照组小鼠血清HBeAg到第6周已基本为阴性;　　1.2第18周，FVB/N小鼠肝内仍有大量HBcAg+细胞存在，而Balb/c小鼠HBcAg+肝细胞到第4周明显较少。HE染色显示，两组小鼠肝组织均未见明显病变，FVB/N小鼠肝内查见炎性细胞浸润。提示该模型能够模拟临床HBV慢性感染;　　1.3各组小鼠淋巴细胞经HBsAg190-197和HBcAg129-140刺激后，与PBS对照组、DRibbles(HBV-)组相比，DRibbles(HBV+)免疫组上清中IFN-γ含量均有显著升高(HBsAg190-197刺激:600 vs50，600 vs15，HBcAg129-140刺激:450vs15，450vs20，pg/ml)。　　2.DRibbles(HBV+)疫苗治疗HBV急性感染的实验研究　　2.1第32天DRibbles(HBV-)组血清HBeAg与PBS组相比没有显著变化(p=0.114)。但DRibbles(HBV+)组血清HBeAg与DRibbles(HBV-)组相比显著降低(S/CO:1.38 vs6.57，p＜0.05)。第18天DRibbles(HBV+)组小鼠血清中ALT显著高于PBS组和DRibbles(HBV-)组(122.7 vs53.3,U/L,p＜0.05;122.7 vs48.0,U/L,p＜0.05)，而第32天DRibbles(HBV+)组小鼠血清中ALT下降至对照组同等水平;　　2.2各组小鼠淋巴细胞经HBsAg190-197和HBcAg129-140刺激后，与PBS对照组、DRibbles(HBV-)组相比，DRibbles(HBV+)免疫组上清中IFN-γ含量均有显著升高(HBsAg190-197刺激:910 vs60，910 vs70，HBcAg129-140刺激:850 vs55，850vs1000，pg/ml);　　2.3第32天，DRibbles(HBV+)免疫组与PBS组、DRibbles(HBV-)组相比，肝内HBcAg+肝细胞的比例明显降低(3％ vs15％，p＜0.05;3％ vs13％，p＜0.05)。HE结果显示，各组小鼠肝内均未见明显病变，DRibbles(HBV+)组小鼠肝组织内查见轻微坏死。提示:DRibbles(HBV+)疫苗对HBV急性感染具有治疗作用。　　3.DRibbles(HBV+)疫苗治疗HBV慢性感染的实验研究　　3.1第12周，DRibbles(HBV+)免疫组血清HBeAg水平与PBS组、DRibbles(HBV-)免疫组相比均无差异(p=0.219，p=0.295);　　3.2 ELISA结果显示，DRibbles(HBV+)免疫组小鼠淋巴细胞经HBsAg190-197和HBcAg129-140刺激后，其培养上清中IFN-γ含含量分别为80pg/ml、55pg/ml。提示:DRibbles(HBV+)疫苗对HBV慢性感染小鼠的治疗效果不明显。　　4.DRibbles(HBV+)疫苗联合B/DRibbles(HBV+)治疗HBV慢性感染的研究　　4.1第12周时，B/DRibbles(HBV+)免疫组小鼠血清HBeAg水平与PBS对照组、B/DRibbles(HBV-)对照组相比均无差异(p=0.076，p=0.489);　　4.2 ELISA结果显示，DRibbles(HBV+)免疫组小鼠淋巴细胞经HBsAg190-197和HBcAg129-140刺激后，其培养上清中IFN-γ含量分别为45pg/ml、22pg/ml。而B/DRibbles(HBV+)免疫组小鼠、PBS组与B/DRibbles(HBV-)对照组小鼠肝内HBcAg+肝细胞的比例无差异(13％ vs15％ vs13.4％)。提示:DRibbles(HBV+)疫苗联合B/DRibbles(HBV+)对HBV慢性感染小鼠的治疗效果仍然不明显。　　5.DRibbles(HBV+)疫苗联合PD-1、CTLA-4封闭性抗体治疗HBV慢性感染的研究　　5.1第12周，联合治疗组（组④）血清HBeAg水平与PBS组（组①）相比明显降低(2.12 vs7.14，S/CO，p＜0.05)，而组①/组②/组③之间均无差异。第10周，联合治疗组（组④）血清中ALT高于PBS组（组①）（110 vs54.7，U/L，p＜0.05），组①/组②/组③之间均无差异。第12周时，联合治疗组（组④）小鼠血清中ALT下降至对照组同等水平;　　5.2 ELISA结果显示，DRibbles(HBV+)免疫组小鼠淋巴细胞经HBSAg190-197和HBcAg129-140刺激后，其培养上清中IFN-γ含量平均水平分别为267pg/ml、150pg/ml，与其他各对照组相比均存差异性;　　5.3第12周，联合治疗组（组④）与PBS组（组①）相比，肝内HBcAg+肝细胞的比例明显降低(6％ vs14％，p＜0.05)，组①/组②/组③之间均无差异。HE结果显示，各组小鼠肝内均未见严重病变，肝内可见炎性细胞浸润与肝细胞变性发生，联合治疗组（组④）小鼠肝内查见片状坏死。提示:DRibbles(HBV+)疫苗联合PD-1、CTLA-4封闭性抗体对HBV慢性感染具有治疗作用。　　结论:　　DRibbles(HBV+)疫苗对HBV急性感染的具有明显的治疗效果，但对HBV慢性感染的治疗效果不明显;联合PD-1和CTLA-4封闭性抗体，DRibbles(HBV+)疫苗对HBV慢性感染能发挥一定的治疗效果。提示:DRibbles(HBV+)疫苗在治疗HBV感染的方面有潜在的应用价值。