【摘 要】
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昆虫的载脂蛋白Apolipophorin-Ⅲ（ApoLp-Ⅲ）为多功能蛋白,不仅具有重要的生理功能,而且在昆虫的先天性免疫中发挥重要作用。前期的转录组和蛋白质组研究表明,家蚕感染球孢白僵菌后ApoLp-Ⅲ（BmApoLp-Ⅲ）基因的表达水平显著上调,推测BmApoLp-Ⅲ参与了家蚕对球孢白僵菌的免疫防御反应。本研究首先利用实时荧光定量（q RT-PCR）检测BmApoLp-Ⅲ基因在家蚕的组织差异性
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昆虫的载脂蛋白Apolipophorin-Ⅲ（ApoLp-Ⅲ）为多功能蛋白,不仅具有重要的生理功能,而且在昆虫的先天性免疫中发挥重要作用。前期的转录组和蛋白质组研究表明,家蚕感染球孢白僵菌后ApoLp-Ⅲ（BmApoLp-Ⅲ）基因的表达水平显著上调,推测BmApoLp-Ⅲ参与了家蚕对球孢白僵菌的免疫防御反应。本研究首先利用实时荧光定量（q RT-PCR）检测BmApoLp-Ⅲ基因在家蚕的组织差异性表达,之后克隆了家蚕BmApoLp-Ⅲ基因的ORF,用原核表达系统成功诱导表达BmApoLp-Ⅲ蛋白,并在体外和体内验证了BmApoLp-Ⅲ蛋白对球孢白僵菌的抑菌作用。家蚕体腔注射重组BmApoLp-Ⅲ蛋白和靶向BmApoLp-Ⅲ的si RNA,在蚕体水平上观察被球孢白僵菌感染家蚕的发病过程和死亡时间;同时检测家蚕免疫通路中相关基因和家蚕抗菌肽基因Bmcecropin A（BmCec A）的表达变化。得到的主要结果如下:1、BmApoLp-Ⅲ基因在家蚕的组织特异性表达谱qRT-PCR检测结果表明,在球孢白僵菌感染家蚕幼虫后,相对于对照组BmApoLp-Ⅲ基因在头、体壁、血淋巴、中肠、丝腺、性腺、马氏管及脂肪体等组织中均有表达,但在脂肪体中的表达量最高,其次是血淋巴,在丝腺中的表达量最低。2、利用原核表达系统成功表达获得BmApoLp-Ⅲ蛋白从脂肪体cDNA中克隆了BmApoLp-Ⅲ的ORF,构建了原核表达载体p ET-28a（+）-BmApoLp-Ⅲ。转化BL21感受态细胞后,用IPTG成功诱导表达重组BmApoLp-Ⅲ蛋白。BmApoLp-Ⅲ蛋白经过纯化浓缩后,使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其浓度为6.4μg/μL。3、家蚕载脂蛋白BmApoLp-Ⅲ对球孢白僵菌有抑菌作用体外抑菌圈试验结果表明,原核表达系统诱导表达的重组BmApoLp-Ⅲ蛋白对球孢白僵菌具有明显抑菌效果。对球孢白僵菌感染的家蚕幼虫体腔注射纯化的BmApoLp-Ⅲ蛋白,可以抑制家蚕体内球孢白僵菌的生长和繁殖,并延缓被感染幼虫的发病和死亡过程。而用RNAi技术沉默BmApoLp-Ⅲ基因后,可以使被感染蚕的LT50和全部死亡时间提前,进一步验证了BmApoLp-Ⅲ对球孢白僵菌的抑菌作用。4、BmApoLp-Ⅲ蛋白可以调控家蚕免疫通路中相关基因的表达对球孢白僵菌感染的五龄幼虫分别注射BmApoLp-Ⅲ蛋白和BmApoLp-Ⅲ基因的si RNA片段,检测家蚕Toll、Imd、Jak/STAT信号通路、丝氨酸氨蛋白酶抑制剂和黑化作用中的关键基因以及家蚕抗菌肽BmCec A基因的表达变化。结果表明注射纯化的BmApoLp-Ⅲ蛋白会上调信号Toll通路中的BmβGRP 4、BmMyd88基因,Jak/STAT信号通路中的BmCTL5、BmHOP基因,丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSerpin5和抗菌肽BmCec A等基因的表达;但下调Imd信号通路BmTak1和BmRelish 2及黑化作用中的BmBAEE的表达。而RNAi沉默BmApoLp-Ⅲ基因可下调BmβGRP1和BmSpaetzle、BmCTL5和BmHOP、BmSerpin2和BmSerpin5和BmCec A的表达,但却上调Imd通路BmPGRP-Lc、BmTak1和BmRelish 2及丝氨酸蛋白酶抑制剂和黑化作用BmBAEE和BmPPO2的表达。上述结果表明,家蚕的BmApoLp-Ⅲ在家蚕防御球孢白僵菌感染过程中不仅有直接的抑菌作用,还能参与免疫信号通路相关基因的表达调控,促进免疫效应因子的表达,间接抑制蚕体内球孢白僵菌的繁殖。研究结果有助于了解明家蚕抵御球孢白僵菌感染的分子机制,同时也可为研究开发家蚕球孢白僵菌的有效防控措施提供有益的参考。
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