背景及目的:病理性血管新生是包括乳腺癌在内的许多恶性肿瘤的特征之一。与正常组织的血管不同,实体瘤的血管不仅生长活跃、结构紊乱,且大多数为无功能血管,而这种结构和功能的异常会导致瘤内缺氧,引起肿瘤生物学行为的进一步恶化。研究显示,传统的抗血管生成药物引起的过度修枝作用会加重肿瘤缺氧微环境,而通过诱导肿瘤血管正常化不仅可以改善瘤内缺氧、抑制肿瘤的生长和转移,还可以增加化疗、放疗和免疫治疗的疗效,因此“血管正常化”这一治疗策略得到了越来越多的关注。目前,诱导实体瘤血管正常化的方法很多,主要是通过选择合适剂量的抗血管生成药物来实现的,如靶向阻断血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的药物。然而,这些药物的临床疗效仍不尽如人意。因此,积极探寻其他诱导血管正常化的方法势在必行。青藤碱是从青藤的根茎中提取的生物碱单体,临床常使用其盐酸盐(盐酸青藤碱)治疗风湿及类风湿性疾病。青藤碱的药理学活性广泛,包括抗炎、免疫调节、抗血管新生、抗心律失常以及轻微的镇静、镇痛作用,近年来的研究还发现青藤碱对肝癌、胃癌、滑膜肉瘤等肿瘤细胞均具有杀伤作用。在类风湿性关节炎的研究中已证实青藤碱具有抗血管生成的作用,而青藤碱对于实体瘤新生血管的作用尚未见研究报道。大量临床前研究提示抗血管生成药物在合适的治疗剂量-时间窗内可以诱导血管正常化。据此,本研究探索了青藤碱对于乳腺癌是否具有抗血管生成的作用,青藤碱是否存在诱导乳腺癌血管正常化的治疗窗以及青藤碱影响乳腺癌血管新生可能的分子机制。方法:1.体外研究:通过台盼蓝拒染实验和MTT法检测了盐酸青藤碱对于人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖活性的影响;使用流式细胞术评价了盐酸青藤碱对于HUVECs细胞周期的影响;采用划痕试验和小管形成试验探索了盐酸青藤碱对于HUVECs功能的作用。2.体内研究:通过体内小鼠成瘤实验研究了不同剂量盐酸青藤碱对于小鼠乳腺癌原位肿瘤和远处转移的影响;采用免疫荧光染色、肿瘤血管灌注实验、免疫组织化学染色等方法检测了盐酸青藤碱对肿瘤新生血管形态和功能的影响;运用抗体芯片技术、酶联免疫吸附试验等方法探索了盐酸青藤碱诱导血管正常化的分子机制。结果:1.台盼蓝拒染实验和MTT法均提示盐酸青藤碱对于HUVECs的活性无显著影响;细胞周期检测发现仅高浓度盐酸青藤碱(1 m M)作用48 h后可使HUVECs发生G1/S期阻滞;划痕试验显示低浓度盐酸青藤碱(62.5μM)即可显著抑制HUVECs的迁移;小管形成实验发现盐酸青藤碱可抑制HUVECs形成网格状结构,且呈剂量依赖性。2.小鼠乳腺癌原位移植瘤实验显示50、100 mg/kg盐酸青藤碱均可显著减少肿瘤的自发转移,其中仅100 mg/kg组的原位肿瘤生长亦被抑制,因此100 mg/kg盐酸青藤碱为该研究所用模型的最佳治疗剂量,转移指数和MTT均提示盐酸青藤碱体内抗瘤抗转移作用并非依赖于它对肿瘤细胞的直接杀伤作用。3.采用最佳治疗剂量我们发现,免疫荧光染色显示药物处理组的肿瘤血管面积显著减少、血管直径增加、血管周细胞包被增加—血管结构正常化;血管灌注实验、免疫组织化学染色等证实药物处理后肿瘤血管灌注增强、瘤内缺氧改善—血管功能正常化;化疗增敏实验证实100 mg/kg盐酸青藤碱与亚治疗剂量的多柔比星(DOX)合用较单药对肿瘤生长的抑制作用更显著;抗体芯片和酶联免疫吸附试验结果提示盐酸青藤碱可以抑制促血管生成因子(b FGF,碱性成纤维细胞生长因子)、促进抑血管生成因子(PF-4,血小板因子-4)的表达和分泌;同时免疫荧光染色还显示药物处理组的肿瘤内部M1型肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)比例增多而M2型TAMs比例减少,髓来源抑制细胞(MDSCs)募集减少。4.200 mg/kg盐酸青藤碱未表现出抗瘤抗转移作用;免疫组化染色显示200 mg/kg组的肿瘤血管面积较100 mg/kg组进一步减少但瘤内缺氧却加重—过度修枝;酶联免疫吸附试验发现200 mg/kg盐酸青藤碱可上调粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、下调粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF);免疫荧光染色提示200 mg/kg组肿瘤组织内部M2型TAMs和MDSCs均增加。结论:1.盐酸青藤碱具有抗乳腺癌血管生成的作用。2.盐酸青藤碱诱导血管正常化的剂量依赖性:(1)盐酸青藤碱的最佳治疗剂量为100 mg/kg,在该治疗窗内盐酸青藤碱可以诱导血管正常化从而改善肿瘤缺氧微环境、抑制小鼠乳腺癌的生长和播散、增加化疗敏感性并促进抗肿瘤免疫,而这一作用的潜在机制与盐酸青藤碱可以降低b FGF、升高PF-4的水平以恢复促血管生成因子和抗血管生成因子间的动态平衡有关。(2)超过治疗窗的剂量(200 mg/kg)并未表现出抗瘤抗转移作用,可能与高剂量盐酸青藤碱上调G-CSF、下调GM-CSF以及对肿瘤血管的过度修枝所导致的免疫抑制微环境有关。