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Lunasin,是从大豆中分离获得的新型天然多肽,分子量为5.0 KD左右,含有44个氨基酸;具有多种功能活性,应用前景广阔。但天然来源的Lunasin多肽含量极低,化学合成成本较高,如何高效获得Lunasin多肽是需要攻克的难题。随着分子生物学与基因工程的发展,利用DNA重组技术高效合成Lunasin多肽使这一设想成为可能。转基因大豆是目前世界上种植范围最广泛的遗传修饰农作物,通过基因工程技术获取优良转基因大豆的手段日趋成熟。本研究利用农杆菌介导的大豆遗传转化,将大豆内源基因Lunasin多肽编码基因转入其基因组中,由35S强启动子启动基因过量表达,筛选高Lunasin含量的转基因大豆株系,建立转基因大豆功能活性评价体系,结合转录组和蛋白质组学分析揭示Lunasin多肽抗癌分子机制。取得以下实验进展:1.转基因大豆的获得:采用农杆菌介导的遗传转化将Lunasin多肽编码基因转入大豆基因组中,目前已获得15个独立的T1代转基因大豆株系。建立了Lunasin多肽高效液相色谱串联质谱联用分析方法,Lunasin多肽在保留时间10.606 min时出峰,其一级质谱分析可检测到多个母离子信号,且表现出多电荷状态。2.转基因大豆分子生物学分析:通过FQ-PCR及Western blot蛋白印迹杂交分析表明Lunasin多肽在大豆中成功表达,且转基因大豆株系12、43、45中Lunasin基因表达量明显升高。酶联免疫定量分析检测其含量,筛选高Lunasin含量的转基因大豆株系。Lunasin多肽在转基因系12、43、45中分别为1.47 mg·g-1、1.32 mg·g-1、1.97 mg·g-1,明显高于受体材料0.94 mg·g-1;表明通过转基因技术提高Lunasin多肽含量这一技术方法可行且有效。3.转基因大豆抗氧化、抗炎、抗癌功能评价:过表达Lunasin基因显著提高了转基因大豆Lunasin多肽富集物的抗氧化活性。LET（Lunasin enrichments from transgenic soybean）对DPPH、ABTS+以及氧自由基的清除能力明显高于LEW（Lunasin enrichments from wild soybean）。在LPS诱发的炎症反应中,LET和LEW样品在系列浓度梯度(0.25-4 g·L-1)范围内对小鼠巨噬细胞RAW264.7无毒性;与LEW相比,LET对RAW264.7细胞中NO及细胞因子IL-1、IL-6释放的抑制活性明显较高。过表达Lunasin基因可显著提高转基因大豆Lunasin多肽富集物的抗癌活性。细胞免疫荧光染色证实Lunasin多肽可进入哺乳动物细胞,定位于细胞核中,在细胞核部位发挥功能。在抗增值试验中,LET、LEW可显著抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增值,且LET抑制能力明显强于LEW;4.Lunasin多肽对乳腺癌细胞增值抑制机理研究:综合应用转录组和蛋白质组测序技术,全面分析Lunasin处理前后细胞内基因、蛋白表达调控,筛选差异表达基因和蛋白,进行GO和KEGG富集分析,挖掘Lunasin多肽抗癌调控分子机制。结果表明Lunasin多肽处理后,细胞内DNA复制和溶酶体通路被显著抑制,细胞凋亡通路显著激活。推测Lunasin多肽可通过抑制DNA复制阻止细胞有丝分裂;抑制细胞自噬,通过溶酶体-线粒体轴诱发细胞凋亡,进而抑制细胞增殖。