视网膜色素变性是一组以进行性感光细胞及色素上皮功能丧失为最终共同表现的遗传性视网膜变性疾病,主要临床特征为夜盲、进行性视野损害及至中心视力丧失。然而,尽管目前已有超过60种相关变异基因被发现,其与视网膜色素变性发病相关的具体生物机制却尚未完全清楚。既往研究发现,虽然可引起视网膜色素变性的变异基因数量繁多,但由这些变异基因所导致的病理及临床特征却是惊人的一致:视杆、视锥细胞进行性凋亡引起的夜盲、周边视野的逐渐丧失,最终导致全视野丧失。并且,不管由于什么原因导致的视杆细胞凋亡,最终都会引起视锥细胞的凋亡,即使这些凋亡的视锥细胞在功能和形态上原本是正常的。针对这一现象,尽管有大量研究工作者提出了许多不同的猜想,如“bystander effect”假设等,最终仍然不能完美解释这种情况。近年来,大量研究发现,线粒体作为细胞生命活动最重要的供能器官,同时还起着调节细胞分化、生长和凋亡的重要作用,在各类神经退行性疾病的发病机制中发挥着不可忽视的贡献。因此,基于以上研究现状,本研究提出如下假设:在视网膜色素变性早期,存在一个关键的始动因子,促使由不同基因变异导致的视网膜变性最终朝向同一种病理和临床表现发展,而线粒体作为细胞生命活动重要供能中心和调节细胞分化、生长、凋亡的重要场所,在其中必然起着不可忽视的作用,甚至可能调节了视锥细胞的凋亡过程。幸运的是,基于质谱检测技术的蛋白组学分析作为一项新兴技术,已被广泛用于生物样本蛋白检测,采用差异蛋白组学的研究方法可以使我们找到在疾病不同阶段有意义的差异蛋白及其在健康与疾病状态下表达量的差异,从而进一步深入研究差异蛋白间相互作用及其最终对疾病发展的影响。本研究将采用基于质谱检测技术的蛋白组学非标定量(label-free quantif1cation)技术,以液相色谱串联组合型高分辨质谱仪为研究平台,分析视网膜色素变性模型鼠RCS大鼠与其同源对照大鼠在变性早期不同年龄阶段(出生后18天、24天、30天、36天)视网膜差异蛋白的表达,并进一步应用生物信息学技术对检测出的差异蛋白间相互作用及其参与的生物信号通路进行深入研究,以分析其与视网膜色素变性的相关因素,找出变性早期相关关键因子。基于以上研究目的,本研究将主要分为两部分进行:一是通过基于质谱检测技术的方法检索RCS大鼠视网膜变性早期蛋白,并筛选RCS大鼠变性早期相关差异蛋白;二是对RCS大鼠视网膜变性早期差异蛋白进行生物信息学分析(主要为基因本体注释和代谢通路及信号通路分析),以筛选鉴定变性早期相关的关键因子。本论文将分为三部分描述该研究方案及主要结果:本论文第一章详细介绍了视网膜色素变性研究背景及研究现状,以及蛋白组学和差异蛋白组学的研究现状和前景,并重点讨论了视网膜色素变性差异蛋白组学分析的研究意义、内容及方法。本论文第二章主要描述通过非标定量技术对实验组RCS大鼠和对照组rdy大鼠的视网膜进行蛋白量分析,采用独样本t检验的统计学方法筛选差异蛋白。对大鼠视网膜样品进行蛋白提取、SDS-PAGE凝胶电泳、胰蛋白酶胶内酶切后,行LC-MS/MS分析。质谱数椐检索同时采用了 MaxQuant软件和MASCOT软件进行对比,对Uniprot数据库中的Rattus norvegicus fasta进行检索分析。本实验中,每个实验组/对照组在不同时间点分别收集2组蛋白白样本,每组蛋白样本分别来自于4个视网膜(2只大鼠)。每组蛋白样本均同时进行了 4次平行LC-MS/MS 重复分析。结果表明,MaxQuant检索重复率明显高于MASCOT。最后,通过独立样本t检验对MaxQuant软件检索结果进行实验组与对照组差异蛋白筛选,得到434个差异蛋白。本论文第三章详细描述通过生物信息学手段,将筛选得到的差异蛋白进行富集分析,以找出最可能与疾病相关的生物及信号通路因子。Gene Ontology富集分析发现,差异蛋白主要位于细胞质及线粒体,参与细胞内生物代谢过程,发挥蛋白结合及催化活性功能;KEGG pathway注释分析发现参与糖酵解通路的酶蛋白表现出显著性表达上调。对差异蛋白上游调控因子分析发现,转录因子E2F1在调节部分相关差异蛋白中发挥重要作用。结合RCS大鼠视网膜差异蛋白组学研究和生物信息学分析,本研究得出以下结论:1.本研究首次通过基于label-free蛋白定量质谱的蛋白组学研究方法检索到2375个大鼠视网膜蛋白,其中RCS大鼠视网膜蛋白共1712个,对照(rdy)大鼠视网膜蛋白共2278个,建立了完整的视网膜色素变性模型大鼠视网膜蛋白组数据库。2.本研究共筛选出434个RCS大鼠视网膜变性早期相关差异蛋白,其中在18d、24d、30d和36d四个时间点分别为201、115、104和109,为进一步分析RCS大鼠视网膜变性早期病理机制提供基础。3.本研究发现RCS大鼠视网膜变性早期相关差异蛋白主要在线粒体内富集,突出强调了线粒体功能障碍在RCS大鼠视网膜色素变性早期中的关键作用。4.本研究发现了转录因子E2F1和glycolysis通路在RCS大鼠视网膜变性早期中异常高表达,提示其参与了视网膜色素变性病理进程。5.本研究发现RCS大鼠视网膜变性中期光转导通路的低表达,为视网膜色素变性中期视功能损伤提供了直接证据。