(一)研究目的近年来,我国经济发展日新月异,人民生活水平出现质的飞跃,医疗技术水平亦随之得到较大提高,原发性肝胆管结石（hepatolithiasis,HL）作为我国常见的良性胆道疾病,其病因繁杂,涉及因素与环节较多,其中以长期反复发作的胆管炎症为其主要病理过程,而胆汁性肝硬化和胆管细胞癌是疾病反复进展的最终结局。因此,探索有效的治疗措施及干预机制,意义重大。目前,临床对于本病的治疗,仍缺乏有效的治疗药物及措施,以对症治疗为主,手术治疗则为对症干预的首选措施,但治疗后肝内胆管结石复发率仍居高不下,尤以年轻患者较为常见,以致于不得不进行再次,甚或是多次手术,给患者及其家庭带来沉重的心理压力和经济负担,因此,深入探明该病发病机理,并针对关键靶位形成有效治疗手段,对患者自身乃至社会发展而言都是亟需解决的关键问题。有鉴于此,本研究一方面以慢性结石性胆囊炎并胆总管继发性结石患者为研究对象,通过分析术后患者的疗效及安全性,以及对其血液相关指标进行观测,并对胆汁进行代谢组学的分析及特征检测,探讨大黄灵仙胶囊对慢性结石性胆囊炎并胆总管继发性结石患者的临床疗效及机制。另外一方面采用高通量miRNA芯片技术、qRT-PCR技术、Northern Blot技术、KEGG富集分析技术,明确胆道炎症诱导胆管细胞miRNA网络失衡特征及大黄灵仙胶囊的干预靶位,以期为大黄灵仙胶囊治疗原发性肝内胆管结石提供更深刻的科学依据。（二）研究方法:第一部分（临床研究）:选取142例慢性结石性胆囊炎并胆总管继发性结石患者,随机分为大黄灵仙胶囊治疗组（治疗组）-72例和消炎利胆片治疗组（对照组）对照组-70例。分别观察治疗前、治疗后证候评分、彩色多普勒上腹部检查,观察胆囊壁和胆结石变化情况、血常规和血清生化常规指标检测、胆汁内源性代谢物特征改变,最终评价其安全性及疗效。第二部分（实验研究）:实验（一）基于NF-κB信号通路探讨大黄灵仙胶囊缓解胆管细胞炎性应激的研究,研究以大鼠胆管细胞为研究对象,以内毒素（LPS）炎性致敏胆管细胞,于48h、72h分离大鼠胆管细胞,采用高通量miRNA芯片技术、qRT-PCR技术、Northern Blot技术、KEGG富集分析技术,检查胆管细胞NF-κB信号通路关键因子及IL-6和TNF-αmRNA表达情况,从细胞水平阐释DHLX对胆管细胞炎性应激的影响。实验（二）以LPS刺激胆管细胞构建模型基础,予以DHLX干预,借鉴现代miRNA芯片技术及生物信息分析技术,分离并培养大鼠胆管细胞,转染miRNA过表达质粒或抑制表达质粒,研究以LPS诱发胆管细胞炎性反应进行研究,予以DHLX干预,借鉴现代研究方法,以qRT-PCR验证靶mRNA表达,miRNA芯片技术结合多元生物信息学分析方法,探索DHLX通过miRNAs对炎性胆管细胞的多元调控机制。（三）研究结果第一部分:（1）两组患者疗效比较:治疗组患者有效率69.40%;对照组有效率51.40%。两组有效率比较,治疗组升高明显,差异有统计学意义（p=0.04）。（2）两组患者治疗前后证候评分积分比较:治疗前,两组患者证候积分比较,差异无统计学意义（p=0.50）;治疗后,与对照组比较,治疗组证候积分降低名称,差异具有显著统计学意义（p<0.001）。组内比较:与治疗前比较,治疗后两组患者的证候评分均降低明显,差异均有统计学意义（p<0.001）。（3）两组患者治疗前后上腹部彩超变化比较:两组患者胆囊B超结果治疗前,两组患者透声差、壁毛糙、壁厚所占比例,差异无统计学意义（p>0.05）。治疗后,与对照组比较,治疗组对胆汁透声差、壁毛糙的改善有效率差异有统计学意义（χ2=4.43,p=0.04;χ2=4.76,p=0.03）;对胆囊壁增厚的治疗情况无明显差异（χ2=1.83,p=0.24）;两组患者胆囊结石的改善情况比较,治疗组患者胆囊结石有效率58.30%;对照组有效率40.00%。两组有效率比较,治疗组升高明显,差异有统计学意义（p=0.03）。（4）两组患者治疗前后血液指标检查比较:治疗前,两组患者WBC、CRP、ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA、TC之间,差异无统计学意义（p>0.05）治疗后,与对照组比较,治疗组患者的WBC、ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA均降低明显,差异均具有显著差异（p<0.001）;组内比较,与治疗前比较,治疗后观察组WBC、ALT、AST、TBIL、DBIL、TBA均降低明显,差异均具有显著差异（p<0.001）;对照组同一趋势,差异均具有显著统计学意义（p<0.001）。（5）两组患者胆汁代谢组学特征检测:主成分集中于椭圆形95%CI内,治疗前主要分布在右侧,治疗后主要分布左侧,同时,可见治疗组经过治疗后代谢物主要分布于左侧的上象限,对照组分布于左侧下象限。胆汁内源性代谢物峰的匹配度均大于800,且未超过1000,可见结果较为可信。组间比较,治疗后,与对照组比较,观察组的丙氨酸、柠檬酸、甘氨酸、胆固醇、甘油、苹果酸、胆碱、牛黄碱浓度变化,差异有统计学意义（p<0.001）,但部分指标如乳酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、LDL指标差异无统计学意义（p>0.05）。组内比较:两组患者在治疗前后代谢物丙氨酸、柠檬酸、乳酸、谷氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、胆固醇、甘油、苹果酸、胆碱、牛黄碱在治疗组和对照组各自治疗前后差异均有显著统计学意义（p<0.001）。（6）安全性观察:治疗过程中及随访期内,对两组患者进行常规检查的复查,主要为心电图、肝、肾功能、尿常规、血常规、粪便常规等,均未见明显异常。治疗组出现3例（4.17%）不良反应。对照组患者出现5例（7.14%）,两组不良反应比较,差异无统计学意义（p>0.05）。第二部分:（1）观察D组的增值率最高,达95%,也就是LPS（5ug/ml）+DHLX（1mg/ml）浓度,从而确定该浓度配置为DHLX 1mg/ml是直接胆管细胞炎性实验（LPS 5ug/ml）的较佳浓度。（2）与空白组比较,LPS对照组、LPS+PDTC组、LPS+SB203580组、LPS+PTDC+SB203580组的Myd88、TRAF6、TAK1、IKKa、NF-κBmRNA表达,均增加明显,LPS+中药组、LPS+PDTC+中药组、LPS+SB203580+中药组、LPS+PTDC+SB203580+中药组,则降低明显,差异均具统计学意义（p<0.05）;与LPS对照组比较,LPS+PDTC组、LPS+SB203580组、LPS+PTDC+SB203580组的Myd88、TRAF6、TAK1、IKKa、NF-κBmRNA表达,有所降低,但无明显差异（p>0.05）,LPS+中药组、LPS+PDTC+中药组、LPS+SB203580+中药组、LPS+PTDC+SB203580+中药组,则降低明显,差异均具统计学意义（p<0.05）;与LPS+中药组比较,LPS+PDTC+中药组、LPS+SB203580+中药组、LPS+PTDC+SB203580+中药组的Myd88、TRAF6、TAK1、IKKa、NF-κBmRNA表达,有所降低,但无明显差异（p>0.05）。（3）与空白组比较,LPS刺激后胆管细胞IL-6及TNF-αmRNA表达显著增高,DHLX干预处理胆管细胞后IL-6及TNF-αmRNA表达明显受到抑制,差异具有统计学意义（p<0.05）。（4）组间比较可见,LPS处理组及LPS+大黄灵仙方处理组,差异表达miR散点分布存在不一致性。（5）将比较所产生的差异表达情况绘制火山图,对差异miR进行靶基因预测,取交集,并进行GO和KEGG分析。大黄灵仙胶囊作用的miR通路集中于TLR4/NF-κB/MAPK通路,基因功能集中于EMT上。（6）DHLX可在胆管细胞炎性条件下,调控miR-140-5p、miR-146a-5p、miR-30b-3p等30个miRNAs表达。（7）将预测得到的靶基因（4517个）进行G0分析,DHLX可影响胆管细胞信号转导、有机化合物反应及缺氧应激等生物学过程,调节细胞质、内质网及膜筏等细胞组份,调控信号转导活性、转录调控区的DNA结合及电压门控钾通道活性等分子生物功能。（8）DHLX可在胆管细胞炎性条件下调控cAMP、cGMP-PKG、HIF-1及TNF-α等信号通路,参与胆管细胞炎性反应的调控。（9）DHLX在胆管细胞炎性条件下可对rno-miR-140-5p、rno-miR-152-3p、rno-miR-221-3p及rno-miR-30b-3p的表达进行调控,影响胆管细胞炎性反应进程。（四）研究结论1.大黄灵仙胶囊与消炎利胆片均可有效防治慢性结石性胆囊炎,但大黄灵仙胶囊效果更佳。2.大黄灵仙胶囊可有效改善胆囊的炎症状态,有一定的排出泥沙样结石的作用,调控血液中血脂及肝功能相关指标,改善患者胆汁代谢组学特征,从结石成因上防止致石性胆汁分泌,且无明显的毒副作用,安全性较高。3.大黄灵仙胶囊可调控胆管细胞中NF-κB信号通路及其下游因子IL-6及TNF-αmRNA表达,缓解胆管细胞炎性应激,减缓疾病进展。4.大黄灵仙胶囊可通过调控miRNAs表达,影响诸多信号转导通路,如HIF-1、cGMP-PKG、TNF-α、PI3K/Akt等,并参与其中的生物过程,从而证实了DHLX对胆管细胞炎性反应的多维调控过程。