目的 软骨组织缺损的修复可通过下列三种方式来完成，即组织移植、人工替代物和组织工程化软骨。组织移植包括自体移植、异体移植和异种移植。人工替代物有医用硅胶和Gore-Tex。组织工程化软骨是过去的十年里出现的一种新兴的组织修复方法，它是应用生物学和工程学的原理的修复损伤的组织。这些方法有的已用于临床近百年，有的是材料学研究的新成果，有的处于实验阶段。它们均因种种原因不能满足临床需要。自体组织移植会造成供区损伤并有组织来源的局限性；同种异体组织移植术后早期尚可被宿主接受，但排斥反应不可避免，异种组织引起的快速排斥反应难于克服，同时也存在社会、伦理方面的问题；以聚合物为主的人工替代物植入后易引起的异物反应，继发感染并露出体外。组织工程化软骨是未来最有希望的软骨修复方式，广义的组织工程包括下面两方面的内容，即应用种子细胞的组织工程和无种子细胞的组织工程。前者将来自病人或基因工程改造的种子细胞在体外扩增并种植在生物可降解的支架材料上，然后再用种子-支架复合体修复病损的组织；后者则是将生物可降解性材料直接植入缺损处，利用其支架功能诱导机体的组织长入支架并再生新生组织。目前前者仍存在种子细胞来源、优选和优化支架材料、如何改善组织工程化软骨的力学性质及移植方式等问题，尚处于实验阶段；后者在组织工程提出之前就有人将其用于临床，如通过冻干或戊二醛等方法处理的骨、神经等都应用了这一原理。脱细胞组织基质的研究出现在上世纪九十年代初，它的原理是通过脱出组织细胞的方法去除组织的移植免疫源性。这种方法一出现立即引起人们的注意，并在九十年代中、后期逐渐成为生物材料领域的又一热点。脱细胞处理的真皮、血管、膀胱等作为相应组织的替代物相继开发成功。它们无论在动物实验及临床应用上都显示出了良好的应用前景。在美国异体真皮基质AlloDerm于1995年获FDA的批准用于临床。在我国，华西医科大学、第二军医大学、第四军医大学、积水潭医院和辽宁省人民医院等也在该领域做了大量的研究工作。但这些研究多以软组织为研究对象，硬组织相关的研究较少，软骨的脱细胞基质开发与研究则是空白，我们对其他组织脱细胞方法的研究和改良，找到了适合软骨的脱细胞方法，本项研究进一步探索了脱细胞处理对软骨组织的组织成分，力学性质、移植免疫源性的影响及如何利用其修复软骨以及应用脱细胞的软骨能否修复缺损的软骨、移植后宿主的局部和全身反应等问题，为软骨的损伤寻求一种新的修复方法。方法 1.软骨的脱细胞处理 通过对Co切rtjtnan四步法改良获得软骨脱细胞处理的方法:(l)浸人低渗0.02%份s/EDTA(pH 8.0)溶液中，溶液内含蛋白酶抑制剂，4℃恒温震荡48小时。(2)l%TritonX一100 Tris/Hcl液(体积/体积)内加蛋白酶抑制剂，4℃恒温震荡48小时。(3) PBS循环冲洗12小时。(4)置人Dnase/Rnase混合液37℃过夜。(5)重新置人0.02%Tris/EDTA(pH 8.0)溶液中，4℃恒温震荡48小时。(6)以蒸馏水连续冲洗48小时，完成对软骨的脱细胞处理。 2.组织学检测 将处理后的样品置人10%中性甲醛固定24小时，行常规HE染色和阿尔新兰染色。 3.透射电镜和扫描电镜观察，1%戊二醛、1%四氧化饿固定，透射、扫描电镜观察。 4.力学分析试验 将30片软骨片切成力学试验构件，编号后随机分为三组，每组10枚，分别进行如下处理，①实验组，脱细胞处理(Acell过arc斌ilage matrix);②对照1组，新鲜猪耳软骨，以PBS保存液保存;③对照2组，0.25%戊二醛固定。处理后各组构件分别以SKN疲劳试验机测试。由试验机记录下相对位移及其对应的拉伸作用力。由相对位移减去初始位移，再除以初始位移，得到拉伸比(动、将拉伸作用力除以构件截面积，为拉伸强度(。)，以8为横轴，q为纵轴，作出的曲线为应力一应变曲线，其主升段的斜率即为弹性模量(E)，从而得出测试弹性物质力学性质的三个主要指标，最大拉伸强度、最大拉伸比和弹性模量。 5.移植免疫相关研究 5 .1免疫组织化学 抗MHC一I单克隆抗体试剂盒购自Newmark公司，sP试剂盒购自福州迈新公司。按说明书描述的方法，1::50抗MHC一I单克隆抗体(New功团改公司)为一抗，滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA一PBS稀释)，适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，DBA显色，苏木素复染。 5.2单个核细胞的分离 取正常成人静脉血加人盛有构椽酸葡萄糖的离心管中待用。50耐离』心管加人25血FicoU一Is叩aq，e离心介质。将静脉血以60“角倾斜注人离心介质之上，转速巧oo转/分钟离心20分钟。吸出后以含10%加热失活的胎牛血清(天津血液病研究所)的RPMI一1640(Gibeol公司)培养液反复洗涤离心三次。获得的单个核细胞以RPMI一1640反复吹打悬浮于RPMI-1创0培养液中备用。 5.3’H一刊R摄人实验 向24孔板的每个孔内加1 x10，个周围血单个核细胞。按下述情况分别分为三组:(l)加人2.5 x 1 xl~的人耳软骨脱细胞基质;(2)加人2.5