【摘 要】
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5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinicacid,简称为ALA）,广泛存在于微生物以及动植物细胞中,是生物体内合成叶绿素、卟啉、胆色素、细胞色素、血红素及维生素B12等必不可少的物质,在农业和医学领域都有着非常广泛的应用。ALA制备方法主要有化学法和发酵法,由于化学合成成本较高,发酵法逐渐受到更多的关注与研究。发酵法产ALA的主要菌株包括经诱变育种的光合细菌和重组微生物。重组微生物中,又
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5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinicacid,简称为ALA）,广泛存在于微生物以及动植物细胞中,是生物体内合成叶绿素、卟啉、胆色素、细胞色素、血红素及维生素B12等必不可少的物质,在农业和医学领域都有着非常广泛的应用。ALA制备方法主要有化学法和发酵法,由于化学合成成本较高,发酵法逐渐受到更多的关注与研究。发酵法产ALA的主要菌株包括经诱变育种的光合细菌和重组微生物。重组微生物中,又以重组大肠杆菌研究得最为普遍。此外,重组谷氨酸棒杆菌也有一些报道。相对而言,以重组酵母产ALA研究相对较少。鉴于酵母在新食品原料生产领域更易被消费者接受,本工作拟以毕赤酵母为宿主开发高产ALA的重组菌。本研究的主要目的是利用代谢工程技术,构建高产ALA的毕赤酵母重组菌。首先克隆了多种不同来源的ALA合成酶基因,并在毕赤酵母GS115中进行表达,根据产物ALA的积累水平,筛选出PpHEM1基因进行后续研究。之后将基因PpHEM1与载体pPIC9K和pPIC9K-PGAP连接,并电转化入毕赤酵母GS115,对电转化后的His+转化子进行遗传霉素抗性梯度筛选,得到25个不同表型、可能含不同目的基因拷贝数和/或整合位点的重组子。对所有重组子进行摇瓶发酵培养,并测定发酵液中ALA产量及胞内提取的ALA合成酶粗酶的比酶活,得到一株重组菌G/PA-Sal-0.5,摇瓶发酵ALA产量可达260.07 mg/L,约为出发菌株GS115发酵产量（13.72mg/L）的19倍。其次,对重组菌G/PA-Sal-0.5的摇瓶发酵条件进行了 一系列的优化,考察了甲醇、甘氨酸、琥珀酸、丙二酸、乙酰丙酸等底物或关键代谢节点的酶抑制剂添加量和添加方式对ALA合成的影响。优化完成后的摇瓶发酵ALA产量最高可达551.05 mg/L,是优化前产量的约2.1倍。在此基础上,进一步在2 L发酵罐上进行了重组菌G/PA-Sal-0.5的高密度发酵,整个发酵过程主要分为三个阶段,分别是甘油批式发酵、甘油补料培养、甲醇补料培养,最终ALA的产量最高达到了 3585.68mg/L。目前公开报道的使用酵母产ALA的研究中,产量较高的为使用毕赤酵母,产量为2256.21mg/L。与之相比,本研究构建的重组菌G/PA-Sal-0.5进一步提高了 ALA的产量,证实了该重组酵母具有高产ALA的工业潜能。
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