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研究背景和目的:宫颈癌是发展中国家第四大常见癌症之一。2012年世界范围内有53万女性诊断为宫颈癌,有26.6万死于该病。1989年,德国病毒学家Harald zur Hausen首先提出了HPV是宫颈癌病因的学说,开启了宫颈癌病因研究的新纪元。此后,大量国内外实验研究和流行病学调查均证明90%宫颈癌病例都与高危型HPV持续感染密切相关。宫颈癌HPV病因学说的确立,揭示了HPV感染与宫颈癌发生发展的关系,促进宫颈癌一级预防（HPV疫苗）和二级预防（HPV筛查）的发展,为宫颈癌的预防、早诊断和早治疗做出了巨大贡献。然而,目前HPV疫苗针对的HPV病毒基因型有限;疫苗的保护期和持续时间还需观察;且既往有HPV感染的妇女接种疫苗无法起到保护作用;目前尚无证据表明HPV疫苗能完全预防宫颈癌的发生发展。同时,晚期宫颈癌患者的联合治疗效果仍不尽人意。因此探寻肿瘤治疗新方向以提高晚期宫颈癌患者疗效和预后仍是宫颈癌治疗的方向。肿瘤的生长、侵袭和转移依赖于肿瘤血管生成满足肿瘤生长过程中必需的氧气、营养物质和其他代谢功能,同时,血运重建也为肿瘤的远处转移提供了结构支撑。肿瘤生长与血管生成的密切相关性引发了抗血管生成治疗的研究,血管生成过程中促血管生成因子和受体也成为重要的靶点,最著名的就是抗VEGF-A的贝伐单抗（bevacizumab）和抗VEGFR2的酪氨酸激酶抑制剂索拉菲尼（sorafenib）,并取得了一定的成效。然而,单靶点抗血管生成治疗的直接作用不能抑制不同类型肿瘤细胞的存活、增殖和侵袭,有研究发现抗血管生成治疗后出现耐药和复发,甚至还有一定的促癌作用。因此,寻求多靶点联合抗血管生成治疗为宫颈癌的联合治疗提供了新思路。NF90与NF45结合形成NF90/NF45异二聚体复合物参与调节DNA代谢,转录,翻译,RNA输出、mRNA稳定性等多种细胞代谢途径。NF90在多种恶性肿瘤中过表达,如鼻咽癌、肝细胞癌、非小细胞肺癌和卵巢癌。NF90能加速肝细胞癌细胞周期进程,促进肝癌细胞增殖;也可通过维持uPA持续表达或增加VEGF-A mRNA稳定性,促进乳腺癌发生发展和血管生成;亦可诱导HPV感染的宫颈癌细胞中E6蛋白表达,抑制宫颈癌细胞凋亡。NF90在多种恶性肿瘤中的作用被广泛研究,也引发了我们探寻其与宫颈癌血管生成的关系,及潜在的分子机制,以期为多靶点抗肿瘤血管生成提供新思路。本研究通过以下三个部分进行。第一部分NF90参与调节缺氧诱导的宫颈癌细胞VEGF-A表达及血管生成第一节ILF3在人宫颈癌组织中高表达目的:通过数据库检索ILF3在人宫颈癌组织中的表达情况,验证ILF3是否在宫颈癌组织中高表达,与宫颈癌是否具有相关性。方法:利用Oncomine（www.oncomine.org）数据库验证ILF3基因在宫颈癌组织和正常组织中表达情况;通过Human Protein Atlas（www.proteinatlas.org）数据库检索ILF3蛋白质在人宫颈鳞癌、宫颈腺癌和正常宫颈组织中的表达情况。结果:在Oncomine数据库中选择样本量较大的Pyeon Multi-cancer数据库分析发现ILF3 mRNA在宫颈癌组织中表达高于正常宫颈组织。Human Protein Atlas数据库显示ILF3蛋白在宫颈鳞癌和腺癌中表达高于正常宫颈组织;结论:利用Oncomine和Human Protein Atlas的大样本数据,发现ILF3在宫颈癌组织中高表达,提示ILF3可能与宫颈癌具有相关性,为后续实验研究提供了临床基础。第二节NF90参与调节缺氧诱导的宫颈癌细胞VEGF-A表达及血管生成目的:体外实验验证宫颈癌细胞缺氧环境NF90蛋白与VEGF-A蛋白表达的相关性;干扰和过表达NF90对VEGF-A蛋白表达以及体外血管生成能力的影响。方法:1.低氧（2%O2）和CoCl2构建宫颈癌细胞缺氧模型,Western blot检测HIF-1α、VEGF-A、NF90、NF110和NF45蛋白表达情况;2.慢病毒转染宫颈癌细胞构建NF90干扰和异位过表达稳定转染细胞株,缺氧刺激后,结合PCR、Western blot、免疫荧光和ELISA验证NF90干扰和过表达后HIF-1α和VEGF-A表达情况3.HUVECs管形成实验和迁移实验验证干扰和过表达NF90后宫颈癌细胞体外血管生成能力。结果:体外实验示,1.在缺氧环境诱导下,HeLa细胞中NF90、VEGF-A和HIF-1α蛋白在缺氧12 h表达最高;SiHa细胞中NF90和VEGF-A在缺氧12 h表达最高,HIF-1α在缺氧24 h表达最高;NF110无明显改变;2.慢病毒转染宫颈癌HeLa和SiHa细胞特异性基因沉默NF90后,HIF-1α和VEGF-A蛋白表达降低,细胞上清液中VEGF-A浓度下降;而异位过表达NF90可显著增强HIF-1α和VEGF-A蛋白表达;PX-478特异性抑制HIF-1α后,NF90过表达诱导的VEGF-A mRNA表达明显下降;3.NF90干扰后,HUVECs管形成和迁移能力被显著抑制;过表达NF90可明显促进上述过程。结论:缺氧诱导NF90、HIF-1α和VEGF-A蛋白的表达,且具有一定的时间依赖性,其中,NF90与VEGF-A蛋白表达升高趋势一致,提示NF90可能与VEGF-A蛋白具有相关性;干扰和过表达NF90均能显著的影响HIF-1α和VEGF-A蛋白表达,以及宫颈癌体外血管生成能力,提示NF90可能成为多靶点抗血管生成治疗的靶点之一。第二部分NF90通过PI3K/Akt信号通路参与调节宫颈癌细胞VEGF-A表达目的:探索NF90促VEGF-A表达潜在的分子机制。方法:使用LY294002、Wortmannin和MK2206抑制PI3K/Akt信号通路,Western blot检测PI3K/Akt信号通路磷酸化情况。结果:干扰NF90后,p-Akt蛋白表达显著降低;过表达NF90促进p-Akt蛋白表达,分别予以LY294002、Wortmannin、MK-2206抑制PI3K/Akt信号通路后,NF90过表达细胞中VEGF-A蛋白表达降低、细胞上清液VEGF-A浓度下降。结论:宫颈癌细胞中,PI3K/Akt信号通路参与调节NF90对VEGF-A表达的促进作用。第三部分干扰NF90抑制宫颈癌细胞裸鼠模型血管生成和肿瘤生长目的:体内实验进一步验证干扰NF90对宫颈癌血管生成和肿瘤生长的影响。方法:分别经皮下注射对照HeLa细胞和干扰NF90的HeLa细胞,构建裸鼠皮下宫颈癌模型,测量肿瘤体积,绘制生长曲线;光声成像活体观察两组宫颈癌模型的血管生成情况,结合免疫荧光检测增殖指标Ki-67和血管生成指标VEGF-A表达情况。结果:NF90干扰组肿瘤体积、质量、血管光声信号、Ki-67和VEGF-A蛋白表达明显低于对照组。结论:体内实验进一步验证了干扰NF90抑制宫颈癌血管生成和肿瘤生长,提示NF90可能成为多靶点抗血管生成治疗的靶点之一。