研究背景对复杂的基因组进行修饰无论对于基础研究还是临床治疗都具有极大吸引力。近几年来,随着人工核酸内切酶技术的不断出现与完善,靶向修饰的梦想逐步变成现实。TALEN就是其中一种,它主要由两部分组成:基于对DNA进行识别的TALE臂和人工改造的核酸内切酶的切割域（FokI）。DNA识别域首先识别并结合到靶位点上,随后切割域FokI形成二聚体,特异性切断靶基因,形成DSB（Double-Strand Breaks）,主要通过 NHEJ（Non-homologous End Joining）和HR（（Homologousrecombination）这两种机制进行DNA损伤修复。而细胞通过NHEJ修复DNA过程中,会导致删除或插入一定数目（非3的倍数）的碱基,造成移码,从而造成靶基因特异性敲除。与原来出现的人工核酸内切酶ZFN相比,TALEN具有多方面的优势:设计简单,组装方便,快捷,特异性高,毒性较低。TALEN与后来兴起的CRISPRCas9相比,虽然后者设计和合成更为简单,但前者脱靶率较低。作为一种新兴的模式动物,斑马鱼与人类基因的同源性高达87%,其调节胚胎发育相关的分子通路也相当保守;斑马鱼还具有体积小,易于养殖,生长周期短,繁殖快,体外受精发育,胚胎透明等独特的生物学特点,非常适用于基因敲除,快速构建特定基因突变的斑马鱼品系。凭借这些优势,应用斑马鱼作为模式动物的科学研究者越来越多,而斑马鱼在各个研究领域的应用模型也相继建立起来。比如白血病模型,免疫系统模型,心血管发育与疾病模型等。这些模型的建立为相关疾病发生发展机制的研究及药物的筛选提供了极大的便利。斑马鱼属于脊椎动物,其造血发育过程与哺乳动物极其相似,大致分为两个阶段:原始造血阶段和定向造血阶段。原始造血阶段有两类细胞生成:原始红细胞和原始髓系细胞。原始红系祖细胞是由位于腹侧中胚层形成的中央细胞群（Intermediate cell mass,ICM）产生的。原始髓系前体细胞则起源于前侧中胚层的喙周血岛（rostral blood island,RBI）,一部分在血液循环开始前在卵黄囊进行分化,随后迁入头部间质,最后迁入上皮组织,包括视网膜,脑（主要是视顶盖）。大约在60hpf时期,所有迁入脑和视网膜的巨噬细胞开始经历特化形成早期的小胶质细胞。从3dpf时期开始,野生型斑马鱼的中枢神经系统中大部分的小胶质细胞集中于中脑背侧视顶盖灰质中。定向造血阶段始于约30hpf时期,此时,背主动脉腹侧壁开始产生造血干细胞。在2dpf时期,这些造血干细胞逐渐迁移至尾部造血组织,最后于5dpf时期,迁至肾脏并在此定居,为机体终生造血。定向造血阶段生成的细胞包括:中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞,肥大细胞,巨噬细胞,红细胞,巨核细胞,血小板,T淋巴细胞,B淋巴细胞和自然杀伤细胞,这些细胞全部由造血干细胞分化发育而来。这些血细胞对机体正常生理功能的维持具有重要的作用造血过程受多种因子调控且涉及时空变化,复杂而又有序。在原始造血阶段,转录因子Gatal和Gfilaa调控原始红系造血,转录因子Pu.1和C/ebp1调控原始髓系造血。Gata1和Pu.1二者相互拮抗,共同调节红系和髓系的命运分化。在定向造血阶段,转录因子Runx1和Cmyb调控造血干细胞（HSCs）的生成,它们同时也是HSCs的标记物。此外,造血发育各个阶段的各种细胞有其表达较特异的标记基因。mpx和lyz标记中性粒细胞;mfap4和mpeg1标记巨噬细胞;αe1和βe1标记红细胞;ikaros、rag1和rag2标记淋巴细胞;c-mpl标记血小板。c/ebp1（CCAAT/enhancer bindingprotein1）特异性地在髓系细胞中表达,其敲低会造成lyz表达减少,但其作为转录因子参与调控的机制却不甚清楚。促血小板生成素受体基因c-mpl敲低会造成血小板的大量减少[1][1],然而,作为人Mp1的同源基因,人们对于其在HSCs发育中所发挥的作用知之甚少。gfi1aa（Growth factor indepedenc1 aa）在原始造血中发挥重要的作用,gf1aa敲低会造成scl和gatal的减少,但对于其作用机制及在定向造血过程中发挥的作用知之甚少。因此,构建这些基因的突变体,进行表型鉴定和基因功能分析,建立疾病模型对于研究造血发育具有十分重要的意义。Retinoblastoma 1（RB1）/p105是被发现并克隆出来的第一个抑癌基因,因其被发现时是作为视网膜细胞瘤的致病基因而得名。RB1是Retinoblastoma（RB）家族成员之一,此家族在调控细胞周期从G1期到S期的过渡中起重要作用,并调控细胞增殖。RB1的失活会导致细胞周期的紊乱和染色体不稳定,这些与肿瘤的发生密切相关。通常,人们认为RB1主要参与视网膜的正常发育,但近年来,随着人们对RB1了解的不断深入,越来越多的证据表明RB1的功能不仅仅局限于,此而是更为广泛。RB1能够参与机体内多个生化过程,发挥各种不同的生物学功能,因此RB1与多种人类疾病的发生和发展都有着较为密切的关系。RB1的失活会导致多种肿瘤的发生,如视网膜母细胞瘤,骨肉瘤,小细胞肺癌,膀胱癌,乳腺癌以及前列腺癌。RB1与毛细胞损伤后的修复也有关系。此外,RB1也是急性淋巴细胞白血病,慢性髓系白血病的致病基因之一,与红细胞的成熟也有关系。在斑马鱼中,rbl基因主要作为抑癌基因用于研究其在各种突变体或模型中的变化。然而对于其自身的功能,尤其是造血方面的研究却少之又少。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象,具有重要的生物学意义。多基因严格控制细胞凋亡,且它们在脊椎动物中非常保守,包括bcl2a家族,凋亡诱导因子Bax,半胱天冬酶（caspase）家族以及p53等。凋亡检测的方法有很多,包括形态学检测,整体末端脱氧核苷酸缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl dUTP nick end-1）,和吖橙（Acridine orange,AO staining）等。本研究首先通过基因编辑技术TALEN分别靶向敲除野生型AB斑马鱼胚胎（F0代）中gfi1aa,c-mpl,cebp1和rb1这四个可能与造血发育密切相关的基因,使F0代体细胞中的靶基因发生突变。我们通过对F0代同AB野生型交配产生的F1代进行相关的基因型检测,从中筛选出可以稳定遗传的突变杂合子F1代,进而再繁殖产生相应的F2代。接着,我们选择中性红染色,苏丹黑B染色以及原位杂交等方法对突变体rb1smu进行与造血发育相关的初步的表型鉴定。最后,我们对突变体rb1smu对应于表型的机制进行探索,以期能够对Rb1的功能有更深入的了解。本文研究内容总共分为三个部分:第一部分为运用TALEN技术构建基因敲除斑马鱼;第二部分为突变体rb1smu表型鉴定;第三部分为突变体rb1smu 的功能分析。第一部分:运用TALEN技术构建基因敲除斑马鱼1.目的本部分的研究主要是利用基因编辑技术TALEN分别靶向敲除野生型AB斑马鱼中gfi1aa,c-mpl,cebp1和rb1这四个可能与造血发育密切相关的基因,进而通过基因型鉴定从中筛选出能稳定遗传的突变体,以用于后续进一步的研究工作。2.方法我们采用常规的TALEN基因编辑技术,通过显微注射TALEN mRNA靶向敲除野生型AB斑马鱼胚胎中相应的基因,获得F0代。将性成熟的F0代与AB野生型斑马鱼外交产生F1代。收集F1代胚胎,通过PCR-限制性内切酶酶切法初筛出生殖细胞突变的F0代,进而大量繁殖相应的F1代。随后对F1代进行相关的基因型检测,从中筛选出可以稳定遗传的突变杂合子F1代,进而再繁殖产生相应的F2代。3.结果经过TALEN mRNA的靶向处理后,我们分别得到相应的F0代斑马鱼。随后我们利用PCR-限制性内切酶酶切和测序作为筛选手段,总共筛选到4种c/ebp1突变基因型的F1代,6种c-mpl突变基因型的Fi代,5种gfi1aa突变基因型的F1代和5种rb1突变基因型的F1代,成功获得了靶向敲除这4个基因的突变体。这些突变体将在后续工作中进行详细的表型和基因功能方面的研究。第二部分:突变体rb1smu表型鉴定1.目的本部分的研究目的首先是对突变体rb1smu进行发育状态观察,然后通过化学染色,原位杂交等不同的表型检测方法对突变体rb1smu进行较为详细的表型分析,从而找到与造血发育缺陷相关的表型。2.方法我们通过体式显微镜观察rb1smu突变体的生长发育状态,并绘制生存曲线。首先,我们使用苏丹黑B染色、中性红染色这两种简单的化学染色方法分别检测突变体rb1su的粒细胞和巨噬细胞的数量及功能进行初筛;随后,我们利用原位杂交来检测突变体rb1smu中各谱系造血发育标记基因的表达情况。我们利用显微注射法直接导入mRNA的方法来进行rb1smu的拯救实验。3.结果1）体式显微镜观察结果显示,斑马鱼rb1smu突变体在受精第4天以前发育正常,与相同发育阶段的WT没有显著差别;但从受精后第4天开始,rb1突变体与WT差别明显:WT在培养皿中自主游动并觅食,但rb1smu突变体则躺在培养皿中,鲜少运动;大部分WT能够正常发育到性成熟,而突变体则从受精后第10天开始相继死亡,到受精后第11天,已经几乎找不到存活的突变体。2)苏丹黑B的染色结果表明,在突变体rb1smu体内,中性粒细胞的数量未发生改变,过氧化物酶的活性也正常。中性红染色的结果表明,受精后4.5天,rb1smu突变体与野生型相比,出现在头部中后脑区域的小胶质细胞的数量有显著性差异（F=8.637,P<0.001）。3)我们通过原位杂交分别检测了各谱系造血的代表性标记基因在rb1su突变体中的表达,分别是:pu.1—标记原始髓系造血,gata1—标记原始红系造血,c-myb—标记定向造血干细胞,lyz—标记中性粒细胞,mfap4—标记巨噬细胞,apoeb—标记小胶质细胞,βe1—标记定向红系造血,rag1—标记定向淋系造血。原位杂交结果显示:pu.1和gata1均能正常表达,提示rb1smu突变体原始造血发育基本正常;c-myb正常表达,提示rb1smu突变体定向造血干细胞发育正常;定向造血阶段lyz、mfap4和βe1正常表达,提示rb1smu突变体定向中性粒细胞,巨噬细胞及红细胞发育正常;apoeb表达量在中后脑区域有显著性差异（F=1.286,P<0.001）,提示rb1smu突变体中小胶质数量显著增多;rag1、rag2及ikaros表达量在胸腺均减少,提示rb1smu突变体中淋巴细胞的发育受到影响而导致细胞数量减少。4)拯救实验的结果表明,直接注射野生型斑马鱼rb1基因的mRNA,使其在突变体胚胎内表达,虽然其表达时间短暂,表达位置过于广泛,但注射mRNA后突变体胚胎与对照组突变体胚胎相比,中后脑区域NR染色阳性的细胞数量有显著性差异（F=9.300,P<0.001）,即野生型mRNA直接注射能够在一定程度上恢复突变体的表型。第三部分:突变体rb1smu的凋亡机制研究1.目的本部分研究的主要目的是通过分析突变体rb1smu中小胶质细胞增多和淋巴细胞减少的表型,进而对这些表型相关的机制进行初步研究。2.方法我们通过整体BrdU免疫荧光染色实验来检测小胶质细胞数量增多是否是因增殖而来。我们通过整体TUNEL免疫荧光染色实验检测中后脑凋亡的细胞是否增多。且在受精后第3天进行整体吖啶橙染色,并通过激光共聚焦显微镜来观察中后脑区域绿色荧光标记的凋亡细胞的数量,以此来比较rb1smu突变体和野生型是否有所不同。我们利用转基因斑马鱼品系Tg（NBT:bcl2a）在rb1smu神经元细胞中过表达bcl2a做NR染色来检测bcl2a过表达是否可以拯救小胶质细胞增多的表型。另外,我们在rb1smu突变体中引入p53缺陷的背景,然后通过NR染色来检测小胶质细胞增多的表型是否是p53依赖的。3.结果1)整体BrdU免疫荧光结果表明,在rb1smu中BrdU与Lcp1共定位的细胞数量明显多于野生型,有显著性差异（F=5.825,P<0.001）,突变体rb1smu增多的小胶质细胞是由增殖而来。2)整体TUNEL免疫荧光结果表明,野生型和突变体中后脑区域TUNEL阳性的细胞的数量有显著性差异（F=5.846,P<0.001）,这提示小胶质细胞的增多是由于神经细胞的凋亡增多造成的。通过整体吖啶橙染色,激光共聚焦显微镜观察发现野生型和突变体中后脑区域AO阳性的凋亡细胞数量存在显著性差异（F=7.060,P<0.001）,rb1smu突变体中绿色荧光标记的凋亡细胞的数量显著增多。3)通过在rb1smu神经元中过表达bcl2a发现:与突变体对照组相比,bcl2a过表达的突变体组NR染色出现的红色信号数量显著减少,两者间数量有显著性差异（F=9.519,P<0.001）,表型得到部分恢复。而双突变体tp53M214Krb1smu与rb1smu突变体相比,NR染色出现的红色信号数量无显著性差异（F=0.765,P=0.956）,这提示小胶质细胞增多的表型是非p53依赖的。全文结论1)我们通过TALEN分别靶向敲除野生型AB斑马鱼中c/ebp1、c-mpl、gfi1aa和rb1这四个可能与造血发育密切相关的基因。总共筛选到4种c/ebp1突变基因型的F1代,6种c-mpl突变基因型的F1代,5种gfi1aa突变基因型的F1代和5种rb1突变基因型的F1代,成功获得了靶向敲除这4个基因的突变体。这表明TALEN靶向敲除是一种成熟稳定且高效的基因编辑方法。这些突变体将在我们今后对于造血发育的研究中起到十分重要作用,并且有望建立起相应的疾病模型。2)我们通过对突变体rb1smu进行表型分析,发现其不能长大至性成熟,从受精后第4天开始运动异常;中后脑的小胶质细胞明显增多,但小胶质细胞的祖细胞-原始造血的髓样细胞未有明显变化;淋巴细胞的数量明显减少,其他谱系几乎不受影响。这说明rb1smu是一种与神经发育及淋巴细胞发育缺陷相关的突变体,需进一步对其机制进行研究。3)通过对突变体rb1smu进行整体BrdU免疫荧光和整体TUNEL免疫荧光实验,我们发现增多的小胶质细胞是由增殖而来。进一步研究发现,凋亡的细胞明显增多,这种凋亡是非p53依赖的;在神经元细胞中过表达bcl2能拯救部分表型,表明凋亡发生在神经元细胞中,且与bcl2a参与的通路有关。