研究背景:乳腺癌是全球女性中最常见的癌症。大约5%-10%的乳腺癌和遗传有关,大多数乳腺癌是散发的[1]。目前乳腺癌的病因尚不清楚。大规模的基因组分析揭示了乳腺癌的分子特征,发现了不同的分子亚型以及潜在的驱动基因[5-6],但这不能从根本上解释乳腺癌的发生发展。目前,乳腺癌基因诊断和靶向治疗逐步应用于临床,并在特定的乳腺癌患者中取得良好效果[7-8]。一些亚型（如基底细胞样型）乳腺癌的预后仍然较差[910]。这提示仍需要对乳腺癌的发病原因进行进一步研究。癌症是遗传和表观遗传修饰的综合表现[13-15]。目前乳腺癌相关的遗传学研究主要包括基因的突变、缺失、非整倍体以及染色体变异等。最近的研究发现低频和罕见遗传变异可能在癌症发生发展过程中起到一定作用[12]。表观遗传学被定义为基因表达活性和表达的可遗传变化,其发生在DNA序列没有改变但是足以调节基因表达水平的变化的情况下[16]。癌症中的表观遗传变化是由DNA和组蛋白修饰的改变引起的,其导致肿瘤抑制基因的沉默和致癌基因的激活,并因此导致细胞表型。除了遗传改变癌基因和抑癌基因的突变,表观遗传学因素如启动子甲基化和组蛋白修饰也可导致乳腺癌的发生,发展和转移[15]。认识到致癌作用涉及遗传和表观遗传变化导致更好地理解主导癌症发展的分子机制,有利于提高预测和诊断癌症水平。表观遗传学可能在药物干预和治疗中发挥作用。近年来研究显示,表观遗传修饰所导致的下游基因表达异常亦是乳腺癌发生发展的重要因素之一[20-22]。Sirtuins是一种高度保守的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性的组蛋白去乙酰化酶家族,在各种细胞过程如代谢,转录和DNA修复中发挥生理作用。SIRT2是sirtuin家族的成员。SIRT2主要定位于细胞质,但也可在有丝分裂期间移至细胞核[31]。SIRT2在G2/M分裂期还可以通过组蛋白H4赖氨酸16（H4K16）的去乙酰化来介导染色质浓缩[106-108]。SIRT2通过下调泛素蛋白连接酶NEDD4的表达来稳定N-myc和c-myc蛋白[70]。SIRT2参与有丝分裂进展,氧化应激,能量代谢,微管聚合,细胞迁移,细胞凋亡和分化。SIRT2维持细胞稳态,包括细胞周期,DNA复制和损伤反应。目前越来越多的证据表明SIRT2参与肿瘤发生[39-42],SIRT2基因的在不同的肿瘤中表达情况是不同的[56-58]。目前报道SIRT2有两个作用相反的功能,作为肿瘤抑制基因或致癌基因与肿瘤发生相关[25-62]。在Sirt2缺乏小鼠模型中出现性别特异性肿瘤发生,雌性乳腺肿瘤和雄性肝细胞癌[38]。虽然越来越多的研究进一步支持SIRT2的肿瘤抑制作用,SIRT2具有促进肿瘤发生的特性亦有报道[19,40]。SIRT2在乳腺肿瘤中的表达降低[38],亦有表达升高的报道[75]。一些SIRT2抑制剂也被报道具有抗癌作用[39 104 109]。SIRT2在乳腺癌发生发展过程的作用是复杂的,目前对于SIRT2基因在乳腺癌中表达调控相关的分子机制仍不清楚。功能性DNA序列变异体（functional DNA sequence variants DSVs）是一种罕见的表观遗传现象,DSVs的出现导致下游基因功能的改变,影响疾病的发生和发展。既往我们对急性心肌梗死（AMI）病人的sirtuin家族成员进行了遗传和功能研究,包括SIRT1,SIRT3和SIRT6。已经鉴定了其启动子内的许多功能性DSVs并与AMI相关[80-82]。我们还发现了 AMI中SIRT2基因启动子内的功能性遗传变异情况[83]。鉴于上述SIRT2与乳腺癌的复杂关系,我们推测SIRT2基因的启动子内DSVs可能在乳腺癌的发生中发挥一定作用。研究目的:本实验主要研究在乳腺癌病人和健康对照人群中对SIRT2基因启动子序列进行测序、并探讨SIRT2基因启动子序列遗传序列变异对乳腺癌发病的影响。根据SIRT2启动子遗传变异序列发生情况,通过基因克隆方法构建pGL3-basic报告基因载体,报告基因载体包含SIRT2基因野生型和突变型。通过双荧光素酶报告系统检测变异的SIRT2基因启动子导致其转录活性的变化,进而检测SIRT2表达水平的变化。通过对乳腺癌病人SIRT2基因启动子变异序列的遗传学及基因表达水平变化的研究,来探讨SIRT2基因在乳腺癌发生发展中作用。研究方法:1、实验组纳入乳腺癌病人200例,对照组纳入健康人群184例,收集这两组人群临床相关资料,然后提取全基因组DNA。1.1入组的乳腺癌病人来自2014年4月至2017年6月期间于济宁医学院附属医院乳腺甲状腺外科住院患者（n=200,年龄26-81岁,中位年龄50岁）。入组病人的乳腺癌病理诊断由济宁医学院附属医院病理科两名高年资病理科医师共同完成。其分子分型具体为:管腔A亚型42例,管腔B亚型93例,HER2阳性亚型33例,三阴性亚型26例和导管原位癌（DCIS）6例。实验组乳腺癌病人均无乳腺癌家族史,临床病理资料具体见表1。1.2正常对照组人群来自于济医附院查体中心同期体检的健康女性或本院内经过相应检查排除乳腺疾病及乳腺癌家族史的健康女性作为对照（n=184,年龄范围从23岁到82岁,中位年龄52岁,具体资料见表1）。2、人类SIRT2（NCBI:NC₀00019.10）启动子引物设计序列由NCBI基因数据库提供;SIRT2基因启动子的基因转录起点（The transcription start site,TSS）位置位于 38899862（+1）,具体引物设计序列的结果见表2;采用PCR方法合成TSS上游需要的1292碱基对序列,并对此DNA片段进行直接测序和分析;统计SIRT2基因的启动子DNA序列变异情况。为确保本实验启动子测序结果的可靠性和准确性,将选定的启动子区域片段截断为2个互相重叠的目的DNA片段进行测序。3、本实验使用 JASPAR program（http://jaspar.genereg.net/）系统对在乳腺癌病人组所发现的SIRT2基因启动子DSVs的功能进行预测分析,推测在乳腺癌病人组中发现的DSVs是否会影响与肿瘤发生相关的转录因子结合位点或者结合效率,从而进一步影响乳腺癌发病过程。4、通过基因测序,本实验在SIRT2基因启动子区域中发现新的DSVs,然后通过基因克隆方法构建pGL3-basic报告基因载体中,报告基因载体包含DSVs及野生型目的基因片段。然后通过细胞转染的方法将构建好的pGL3-basic报告基因载体和内参质粒pRL-TK转染至 HEK-293细胞系（人胚肾细胞细胞系）,MCF-7细胞系（人乳腺癌细胞系）和BT-474细胞系（乳腺浸润性导管癌细胞系）,使用Promega荧光分析仪检测转染后细胞中SIRT2基因启动子的相对荧光素酶活性,通过与野生型启动子的活性比较,分析启动子区域遗传变异序列导致SIRT2基因启动子转录活性的影响。5.统计学分析方法统计学分析使用 SPSS 13.0软件进行,计量资料采用单项方差分析（One-Way ANOVA）进行,两组间计量资料统计学分析方法采用t检验进行,以平均数土标准差表示。两个率或两个构成比的条件下采用卡方检验的统计学分析方法进行。设定P<0.05具有显著统计学意义。研究结果:1、分析测序结果在本次实验中,我们在乳腺癌病人组和健康对照组中共发现8个DNA 序列变异（DSVs）位点,其中包括3个SNPs位点,所有的位点位置及频率可见图3和表3。在两名具有管腔B亚型（年龄41岁和50岁）的乳腺癌中鉴定出两种新的杂合DNA序列变体（DSVs）（g.38900839G>C 和 g.38900478G>A）,对照组没有发现。在健康对照中发现三种新的杂合DSVs,g.38900413A>C,g.38900030G>A和g.38899852C>T。此外,在乳腺癌组和对照组中均发现三个 SNP,g.38901007delT（rs10713585）,g.38900145C>T（rs 1169001 77）和 g.389002910 G（rs2053071）。SNP,g.38900145C>T（rs116900177）,在对照组中比乳腺癌组出现几率高（P<0.05）。DSVs和SNPs的测序色谱图见图3。2、用JASPAR program对结果进行分析使用 JASPAR program（http://jaspar.genereg.net/）系统分析在乳腺癌病人中发现2个新的DSVs,进而推测新发现的DSVs是否会进一步影响肿瘤相关的转录因子转录效率或者改变其结合位点、进而影响乳腺癌的发病过程。经软件分析发现在乳腺癌病人中发现新的DSVs可能会修饰、消除或者产生新的肿瘤相关的转录因子结合位点。我们通过JASPAR软件的预测分析结果推测,SIRT2启动子中发现的新DSVs可能影响着某些肿瘤相关的转录因子结合位点或者改变其与相关转录因子结合的效率,从而影响SIRT2基因的表达水平,参与乳腺癌的发生发展的过程。3、本实验成功构建了报告基因pGL3-basic载体,包括:pGL3-WT（野生型SIRT2 基因启动子）、pGL3-basic空载体（阴性对照）、pGL3-38900839C、pGL3-38900478A 和 pGL3-38900291G（在两组中有类似出现频率的SNP P>0.05）。结果见图5图6。4、采用基因克隆方法将变异型和野生型SIRT2基因启动子序列构建到荧光素酶报告基因表达载体（pGL3-basic）,包括pGL3-WT（野生型SIRT2基因启动子）、pGL3-basic空载体（阴性对照）、pGL3-38900839C,pGL3-38900478A 和 pGL3-38900291G。经体外脂质体转染培养的细胞系HEK-293细胞系（人胚肾细胞系）、MCF-7细胞系（人乳腺癌细胞系）和BT-474细胞系（乳腺浸润性导管癌细胞系）后,收集细胞以及双荧光素酶,采用双荧光报告系统测定萤火虫荧光素酶活性/海肾素荧光素酶活性比值。设定野生型启动子的转录活性为100%,分析计算SIRT2基因变异型启动子（DSVs）的相对转录活性。结果见图7。（1）在HEK293 细胞系中,在乳腺癌组中鉴定的DSVs（g.38900839G>C 和 g.38900478G>A）显著降低了 SIRT2 基因启动子的活性。转录活性:g.38900839G>C（P<0.01）和 g.38900478G>A（P<0.01）均可显著降低SIRT2基因启动子的转录活性,（结果见图7）。在乳腺癌组和对照组中发现具有相似频率的SNP,g.38900291C>G（rs2053071）没有改变HEK293细胞系中SIRT2基因启动子的活性（P>0.05）,（结果见图 7）。（2）为了进一步研究DSVs在乳腺癌细胞中的作用,我们在MCF-7细胞和BT-474细胞中检测了乳腺癌组发现新的DSVs（g.38900839G>C和g.38900478G>A）转录活性。两种DSVs均显著降低了 MCF-7细胞系和BT-474细胞系中SIRT2基因启动子的活性（P<0.01）（结果见图7）。类似地,在乳腺癌组和对照组有类似出现频率的SNP,g.38900291C>G（rs2053071）没有显著改变 MCF-7 细胞和 BT-474 细胞SIRT2基因启动子的活性（P>0.05）（结果见图7）。在乳腺癌组中鉴定的2个新的DSVs改变了 HEK-293细胞、MCF-7细胞和BT-474细胞中SIRT2基因启动子的活性,表明它们对SIRT2基因启动子的作用不是组织特异性的。总结本实验通过对乳腺癌病人组和健康对照组中人类SIRT2基因启动子进行遗传和功能分析,在乳腺癌病人组中鉴定了 SIRT2基因启动子的两个新型DVSs,新发现的DSVs显著改变了人胚肾细胞系和乳腺癌细胞系中SIRT2基因启动子的转录活性,表明这两个新型DSVs对SIRT2基因启动子的作用不是组织特异性的。本实验数据提供了支持性证据证明SIRT2可能作为乳腺肿瘤抑制因子起作用。SIRT2基因启动子DSVs可能通过改变SIRT2基因启动子的转录活性来改变SIRT2表达水平,为乳腺癌发生发展的罕见危险因素。我们的实验结果从表观遗传学的角度扩充了乳腺癌发病的危险因素,可为研究乳腺癌的基因表达调控和靶向治疗提供遗传学基础。该研究的局限性在于样本量相对较小,还需要更大样本量来研究SIRT2基因启动子DSVs的发生情况。我们实验室正在进一步研究DSV如何影响SIRT2基因表达的调控机制。对于SIRT2在乳腺癌发病过程中的具体表达调控机制还需要进一步的研究。