一株新鉴定的棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒基因组分析

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杆状病毒具有闭合环状双链DNA基因组,是一类主要感染鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫的病原物,杆状病毒作为生物杀虫剂具有对人畜安全,不造成环境污染,宿主专一性强,能有效控制田间害虫种群密度等优点。本文对一株分离自棉铃虫的核型多角体病毒进行电镜观察,表明其为多粒包埋型的核型多角体病毒,昆虫感染实验表明其与棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HearSNPV)有不同的宿主域,细胞感染实验表明其与HearSNPV有不同的病理效应,因此对其基因组进行了分析,并与其它杆状病毒基因组进行了比较。对一株分离自棉铃虫的病毒纯化后进行电镜观察,发现其呈不规则多角体型,包涵体中有多个包含病毒核衣壳的囊膜,每个病毒囊膜内含有2个以上核衣壳,符合多粒包埋型核型多角体病毒特征,将其命名为棉铃虫多粒包埋型核型多角体病毒(Helicoverpa armigera multinucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HearMNPV)。荧光定量PCR结果分析表明HearMNPV的DNA在棉铃虫体内复制经历了减少期、隐晦期、增长期及稳定期4个时相,表明其宿主体内复制良好。HearMNPV对其它昆虫的感染性实验表明它对东方粘虫有较好的感染性,但不能感染斜纹夜蛾及甜菜夜蛾,而HearSNPV不能感染东方粘虫,表明两者有着不同的宿主域。HearMNPV对Hz-AM1细胞系感染后没有多角体产生,也不显示明显的细胞病理效应;对棉铃虫胚胎细胞系QB-Ha-E-5细胞系感染后有大量多角体产生,呈现较好的感染性。Hz-AM1是HearSNPV的敏感细胞系,用源自HearSNPV的HaBacmid-egfp对QB-Ha-E-5细胞系感染,细胞感染后有明显的荧光产生,表明HearMNPV和HearSNPV对宿主细胞感染性存在不同。为进一步分析HearMNPV,将Sau3AⅠ部分酶切HearMNPV基因组DNA,SalⅠ完全酶切pUC19载体,以Klenow酶分别对回收的片断和载体进行半补齐反应,经连接、转化后,得到用半补齐法构建的覆盖率大于99.9%的HearMNPV基因组文库。对HearMNPV基因组全序列进行测定并分析表明基因组的大小为154,196bp,G+C含量为40.07%,推测含有162个与相邻的ORF有最小重叠且大于150bp的ORF,占基因组全序列的90.16%,4个同源重复区等非编码区序列占整个基因组的9.84%。基因对等图表明HearMNPV与HearSNPV共线性较低,HearMNPV基因组结构与披肩粘虫核型多角体病毒B株(Mamestraconfigurata nucleopolyhedrovirus-B,MacoNPV-B)有很好的共线性;系统进化分析表明HearMNPV与HearSNPV不在同一簇中,而与MacoNPV-B存在同一簇中。HearMNPV与HearSNPV在基因组的大小、内容,同源基因的排列、一致性上存在着显著的差别,结合昆虫宿主域实验确定HearMNPV是一株不同于棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(HearSNPV)的新病毒种。与MacoNPV-B基因组结构相比,HearMNPV缺失了包含ORF54、55、56、57、58的片断,长度约为5.4kb,其基因组中HearMNPV orf66、orf17、bro基因、hr序列与MacoNPV-B存在明显的不同,表明其与MacoNPV-B的亲缘关系然很近,但在基因组的结构上存在明显的差异。
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