癫痫(epilepsy)是神经系统常见疾病,严重危害人类健康,给社会、家庭和个人都带了来沉重的负担,我国目前约有900万癫痫患者,患病率为5%‰～7‰,其中约有20%—40%的患者用现有的抗癫痫治疗方法不能很好地控制发作,演变为难治性癫痫,颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy, TLE)是其中最常见的类型。近年来对对TLE的病因、病理及发病机制的研究取得了巨大进展,但其发病机制目前尚未完全阐明,药物及手术治疗均难以取得明显疗效。氯化锂—匹罗卡品致痫大鼠行为学、神经电生理学和海马神经元损伤的病理学改变均与人类颞叶癫痫相似,因此是目前研究癫痫持续状态(status epilepticus, SE)和TLE的常用模型之一。反复癫痫发作能造成神经元损伤已被广泛认可,但癫痫发作致神经元损伤的分子生物学机制目前仍不十分清楚。因此进一步探讨癫痫的病因及发病机制,探索新的神经保护药物及潜在作用机制,具有重要的理论和现实意义。NAP (napvsipq)是一种人工合成的辛肽化合物,是活性依赖性神经保护蛋白(activity-dependent neuroprotective protein, ADNP)的活性肽段,它的发现源于对血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)的研究[5,6],后者是一种肽能神经递质,可以刺激神经胶质细胞分泌神经营养素包括ADNP。NAP已经被证实在极低浓度(毫克每千克体重)即具有很强的生物活性,它可以对抗由β淀粉样蛋白(A β)、兴奋性毒素NMDA、电阻滞、HIV衣壳蛋白(GP120)、多巴胺、H202和锌超载等所引起的细胞损伤；NAP还可以保护ApoE敲除的大鼠、闭合性脑损伤、胎儿酒精中毒和中风的大鼠的大脑神经元免受损伤,在不可逆的局部脑缺血模型中,发现应用NAP可以减少梗死面积,显著降低凋亡神经元数目。近年来,对NAP的神经保护作用机制的研究也日益深入,有研究提示NAP可以通过介导线粒体凋亡途径发挥神经保护作用。NAP具有抗凋亡及神经保护作用已被广泛认可,但其是否能在癫痫引起的脑损伤中发挥保护作用目前研究甚少。因此,本课题建立氯化锂—匹罗卡品致痫大鼠模型,探讨癫痫发作后海马神经元损伤的病理学特征及分子生物学改变；检测腹腔给予外源性NAP对匹罗卡品致痫后大鼠海马神经元线粒体凋亡通路相关蛋白水平的变化及氧化应激水平的改变,深入探讨NAP对癫痫发作后海马神经元是否具有保护作用及其可能的机制。本研究分两个部分：第一部分氯化锂-匹鲁卡品大鼠急性癫痫模型的建立及对海马神经元损伤的病理学和分子学观察目的1建立氯化锂-匹鲁卡品诱发的大鼠颞叶癫痫的模型。2观察氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠行为学及海马组织病理学改变。3研究氯化锂-匹罗卡品致痫后不同时间点大鼠海马线粒体凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和活性caspase-3水平的变化,进一步探讨癫痫后大鼠海马神经元损伤的分子生物学机制。4研究氯化锂-匹鲁卡品致痫后不同时间点大鼠海马氧化应激水平的改变。方法1健康成年雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、癫痫组,后者又分为癫痫发作后2h、6h、6h、24h和72h组2癫痫组大鼠腹腔注射氯化锂-匹罗卡品诱发SE,观察大鼠行为学改变,SE持续60min后腹腔注射地西泮终止发作。3癫痫组各组部分大鼠在相应的时间点断头取脑,分离海马,提取蛋白,Westernblot法检测各组大鼠海马Bax、Bcl-2和活性caspase-3的水平。4癫痫组各组剩余大鼠在相应的时间点断头取脑,分离海马,制成细胞悬液,酶标仪测细胞氧化应激水平。5癫痫发作后24h组,用多聚甲醛灌注取脑,石蜡包埋、切片,HE和Nissl染色观察大鼠海马神经元损伤情况,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling, TUNEL)法检测细胞凋亡。结果1根据Racine发作评分标准,发作达到ⅣV-V级的大鼠被认为是诱发SE成功(表现为双侧前肢的阵挛、抽搐及全面性强直.阵挛发作,双侧后肢强直伴身体直立、躯干背曲强直、跌倒)。氯化锂-匹鲁卡品诱发大鼠SE成功率为89.3%,潜伏期39.5+18.6mmin。2HE和Nissl染色显示：正常大鼠海马CA1和CA3区锥体细胞排列整齐,细胞结构清晰完整,细胞核结构正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富；癫痫组大鼠海马的CA1和CA3区部分神经元丢失,排列疏松,细胞轮廓模糊,细胞结构不清,部分神经元胞体皱缩,核固缩,胞浆深染,胞浆内尼氏小体减少。3正常组大鼠海马CA1和CA3区TUNEL染色未见阳性细胞,癫痫组大鼠在SE后24h TUNEL染色阳性细胞较正常组大鼠明显增加(P<0.05)。4较正常组相比,癫痫组大鼠海马Bax的表达显著增高(p<0.05),而Bcl-2的水平则明显降低(p<0.05)；癫痫发作早期caspase-3无活性,直到癫痫发作后24h caspase-3才被激活(p<0.05)。5SE细胞内ROS水平升高,3h升高明显,6h达到高峰结论根据氯化锂-匹鲁卡品腹腔注射后大鼠的行为学改变说明氯化锂-匹鲁卡品腹腔注射可致大鼠急性癫痫发作(即SE),氯化锂-匹鲁卡品致痫后可以引起大鼠海马神经元的损伤、细胞内氧化应激水平的改变和细胞凋亡,细胞凋亡可以通过调节线粒体凋亡途径引起。本研究阐明了癫痫后海马神经元损伤的可能分子生物学机制,为进一步研究癫痫的神经保护治疗提供理论依据。第二部分神经保护多肽NAP对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元的保护作用目的研究神经保护肽NAPVSIPQ对氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠海马神经元线粒体凋亡相关蛋白表达水平和细胞内氧化应激水平的影响,进一步探讨NAPVSIPQ对癫痫后海马神经元的保护作用及其可能的机制方法1成年雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、匹鲁卡品组、匹鲁卡品+生理盐水组和匹鲁卡品+NAP组,观察各组大鼠的行为学差异。2癫痫发作后24h灌注取脑、Nissl染色观察各组大鼠海马神经元损伤情况,并且测定海马CA1和CA3区神经元存活数。3癫痫发作后24h断头取脑,分离海马,Western blot法测定各组海马Bax、 Bcl-2和活性caspase-3的水平。4癫痫发作后24h断头取脑,分离海马,酶标仪检测各组海马细胞内氧化应激水平。结果1NAP对匹鲁卡品诱发的大鼠癫痫发作潜伏期、发作程度及急性期死亡率没有明显影响。2Nissl染色显示正常大鼠海马CA1和CA3区细胞结构排列整齐紧密,细胞结构清晰,细胞核结构清晰,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富。癫痫发作后24h大鼠海马CA1和CA3区细胞排列紊乱、部分神经元丢失,胞质浓缩,核固缩,染色质分布不均,胞质内尼氏小体减少。NAP干预的大鼠海马CA1和CA3区细胞结构完整,少量细胞出现染色质凝集现象。较正常对照组,癫痫发作后24h神经元存活数明显减少(p<0.05),而NAP显著减少了癫痫导致的神经元丢失(p<0.05),而匹鲁卡品组和匹鲁卡品+生理盐水组神经元存活数无明显差异。3与匹鲁卡品组相比,NAP+匹鲁卡品组大鼠海马Bcl-2水平明显升高(p<0.05),而Bax和活性caspase-3水平显著降低(p<0.05)。匹鲁卡品+生理盐水组上述指标水平与匹鲁卡品组无明显差异。4与匹鲁卡品组相比,NAP预注射组大鼠SE6h后海马氧化应激水平明显降低(p<0.05)。结论NAPVSIPQ可以上调Bcl-2/Bax水平,抑制caspase-3的激活,从而通过抑制线粒体凋亡途径抑制氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠癫痫发作后海马神经元凋亡同时可以降低细胞内氧化应激水平,减轻氧化应激损伤,从而减轻癫痫导致的海马神经元损伤,也为癫痫后神经元保护治疗提供新的治疗靶点。研究意义本研究用氯化锂-匹鲁卡品诱发大鼠癫痫发作作为颞叶癫痫的大鼠模型，深入研究了线粒体凋亡通路和氧化应激损伤在癫痫发作导致致的海马神经元损伤中所起的作用，第一次证实了ADNF活性神经短肽NAPVSIPQ在氯化锂-匹鲁卡品所致的癫痫中通过调节线粒体凋亡相关蛋白的表达和降低细胞内氧化应激损伤发挥神经保护作用。尽管研究中并未发现NAPVSIPQ可以减轻癫痫发作潜伏期和发作程度，但研究结果有助于阐明痫性发作导致神经元损伤的分子生物学机制及NAPVSIPQ神经保护作用的可能机制，为癫痫的神经保护治疗提供了新的思路。