牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)具有广泛的组织嗜性,侵害的组织不同而表现出不同的临床症状,如鼻气管炎型、生殖道感染型、结膜炎型和脑膜脑炎型等。IBR在临床上常呈隐性感染并持续性排毒,给全球的养牛业造成很大的经济损失,世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告性动物疫病,我国也将其列为进出口牛的检疫疾病之一。IBRV基因组编码11种糖蛋白,其中gB蛋白是病毒囊膜表面展示的主要蛋白之一,也是主要的免疫原蛋白,在病毒致病过程和刺激机体产生抗体过程中均起较大的作用。本研究根据GenBank已公布的IBRV Bartha Nu/67株基因序列,利用生物学软件DNASTAR对gB基因进行分析,同时参考相关资料,找出gB基因组上的5个抗原位点,利用生物学软件Primer Premier 5.0设计6对引物,其中两对引物(内引物和外引物)为采用嵌套式PCR整体扩增IBRV gB基因的引物,另外4对为扩增5个抗原位点的引物。在内引物和扩增5个抗原位点的4对引物中导入EcoRⅠ和SalⅠ两个酶切位点。将IBRV gB基因连接到克隆载体pMD18-T,即pMD18-T-gB。以重组pMD18-T-gB为模板扩增5个抗原位点,并将5个抗原位点片段连接到克隆载体pMD18-T和表达载体pGEX-6p-1,转入E. coli BL21 (DE3)中进行表达,表达的蛋白分子量大小与预计相符,分别为40.3kDa、39kDa、37.8kDa和38.7kDa。采用免疫印迹试验和间接ELISA检测到重组蛋白具有较好的反应原性。对表达条件进行优化,结果表明异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的终浓度为1mmol/L、37℃诱导3h时表达量最高,4个重组蛋白分别占菌体蛋白的49%、45%、46%和48%。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,用GSTrap HP层析柱纯化得到高纯度的重组蛋白,其中gB3纯度为95.27%。利用MDBK细胞增殖Nu/67株IBRV全病毒,经蔗糖密度梯度离心纯化后,测定蛋白含量,作为抗原与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂混匀制备免疫原,分4次免疫4～6周龄BALB/C雌性小鼠,免疫剂量为100μg/只,最后一次倍量加强免疫,3天后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经多次克隆和间接ELISA筛选,获得能够稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别为命名为C5F4和3D5,经鉴定,C5F4和3D5两株分泌的单克隆抗体均为IgG1亚类,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、赤羽病病毒(AKAV)、牛流行热病毒(BEFV)和茨城病病毒(IBAV)均无交叉反应,显示出良好的特异性。通过间接ELISA测定,C5F4株单克隆抗体效价分别为:细胞上清液1:1600,腹水为1:12800;3D5株单克隆抗体经纯化后测定其效价为:细胞上清液1:1280,腹水为1:25600。连续培养20代后仍能稳定分泌抗体,这些单克隆抗体的获得为IBR的研究及诊断方法的建立莫定了良好的基础。采用纳米金标记技术制备了具有良好均一性、平均粒径为22.7nm的纳米金粒子,确定了胶体金溶液的最佳pH值为7.5,通过对不同浓度单抗溶液与胶体金比例的测定,确定30μg单克隆抗体的加入量作为实际最小蛋白标记量。对IBRV病毒液(107。0TCID50/0.1mL)从10-1进行10倍递进稀释至10-8后,吸取100μL滴加于试纸条加样孔中,反应10min,测试条在检测区和质控区各出现一条红色反应带,均呈阳性反应,表明所研制试纸条的敏感性为10-5,即100 TCID50;将试纸条插入到BVDV、AKAV、BEFV和IBAV等几种病毒样品中,无交叉反应。分别对10份已知阳性样品和10份已知阴性样品用该试纸条进行检测,每份样品进行重复5次,5次检测结果均一致。试纸条的稳定性试验表明,4℃保存条件下保存两个月具有良好的稳定性。将临床上采集的246份鼻腔棉拭子用试纸条进行检测,并用PCR检测方法进行比较,这两种方法的阴性符合率在99.17%。本研究利用重组IBRV-gB3蛋白作为检测抗原,待检测血清作为阻断抗体,1株单抗(3D5)作为阻断ELISA的检测抗体,建立了gB3阻断ELISA检测方法。ELISA的工作条件为:gB3最佳包被浓度为0.78μg/mL,阻断抗体最佳稀释度为1:15000,待检血清最佳稀释度为1:20,兔抗鼠酶标二抗工作浓度为1:15000。利用新建立的gB3阻断ELISA对38份保存的牛阳性血清检测结果表明,本方法的敏感性为97.37%,特异性为96.16%,交叉反应试验证明本方法与牛病毒性腹泻、赤羽病、牛流行热、茨城病和牛结核等5种阳性血清不发生交叉反应,使用该方法进行重复性试验,其板内、板间变异系数均小于10%,对1300份进境种牛血清进行了临床检测,并与国外进口试剂盒进行比较,本研究建立的gB3阻断ELISA共检出阴性1223份,国外进口试剂盒检测出1286份阴性,阴性符合率达到95.10%。本课题建立的纳米金技术检测IBRV病原及gB阻断ELISA检测IBR抗体的方法,有望在进出境种牛检疫过程中替代其它方法,联合其它方法应用,不仅对进出境种牛的检疫提供可靠、实用、经济的检测方法与诊断试剂,也可在我国疫情监控、疾病预警方面起到积极的作用。