论文一Ghrelin对大鼠骨髓内皮祖细胞体外生物学活性的影响及其机制研究　　 第一部分 Ghrelin对大鼠骨髓内皮祖细胞体外生物学活性的影响　　 目的：探讨生长激素促分泌物受体的内源性配体(ghrelin)对大鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)体外生物学活性的影响。　　 方法：采用密度梯度离心法分离获得大鼠骨髓的EPCs，以细胞结合FITC所标记的荆豆凝集-1(FITC-UEA-1)、吞噬Dil所标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)进行EPCs检测，并使用CD34、CD133、人血管性血友病因子(vWF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的酪氨酸激酶受体(Flk-1)等抗体进行免疫细胞化学染色法来鉴定细胞。使用不同浓度的ghrelin(10-9～10-6mol/L)孵育EPCs后，通过WST-8法检测EPCs的增殖能力、Transwell小室迁移实验检测EPCs迁移能力、在Matrigel基质胶上检测EPCs小管样结构形成能力、Griess法检测EPCs细胞培养上清液中一氧化氮(NO)含量。　　 结果：新分离培养1天内的内皮祖细胞近似圆形，第4～7天后转化为梭状的贴壁细胞，培养第10天细胞呈条索样排列生长。FITC-UEA-1和Dil-acLDL双染阳性，CD34、CD133、vWF和Flk-1免疫细胞化学染色均呈阳性。分别用浓度为10-9～10-6mol/L的ghrelin干预EPCs，发现10-8mol/L及10-7mol/L的ghrelin可明显促进EPCs的增殖、迁移、小管样结构形成及NO分泌(P＜0.05)。　　 结论：Ghrelin呈一定的浓度依赖性地促进EPCs的增殖、迁移、小管样结构形成及NO分泌等生物学活性，提示其可能成为治疗缺血性疾病的新策略。　　 第二部分 ghrelin促进大鼠骨髓内皮祖细胞体外生物学活性的机制研究　　 目的：探讨ghrelin促进EPCs生物学活性的信号分子机制　　 方法：用不同浓度ghrelin(10-9～10-6mol/L)处理EPCs15min，并用10-7mol/L的ghrelin干预0～60min，使用Western-blot检测蛋白激酶B(Akt)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及其磷酸化表达;分别用GHSR1a抑制剂[D-Lys3]-GHRP-6、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的抑制剂LY294002和eNOS的抑制剂L-NAME预先处理EPCs，检测其对ghrelin介导的Akt、eNOS磷酸化的表达及细胞增殖、迁移、小管样结构形成及NO分泌影响。　　 结果：Ghrelin呈剂量依赖性及时间依赖性地促进EPCs表达磷酸化Akt和eNOS; GHSR1a抑制剂[D-Lys3]-GHRP-6能显著抑制ghrelin诱导的Akt、eNOS磷酸化表达;PI3K抑制剂LY294002能显著抑制ghrelin诱导的Akt、eNOS的磷酸化表达;eNOS的抑制剂L-NAME能显著抑制ghrelin诱导的eNOS磷酸化表达，但是对Akt磷酸化表达无影响。同时，[D-Lys3]-GHRP-6、LY294002及L-NAME均能显著抑制ghrelin诱导的EPCs的增殖、迁移、小管样结构形成及NO分泌(P＜0.05)。　　 结论：Ghrelin通过激活GHSR1a/PI3K/Akt/eNOS信号途径促进骨髓EPCs增殖、迁移、小管样结构形成及NO分泌等体外生物学活性　　 论文二危重症患者血浆活性ghrelin水平的变化及意义　　 目的：探讨危重症患者的血浆活性ghrelin水平的变化及可能的机制。　　 方法：选择ICU危重症患者127名，另选30名健康体检者为对照组。应用酶联免疫吸附试验测定血浆活性ghrelin、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6（IL-6）水平，同时记录相关临床数据。　　 结果：(1)危重症患者血浆活性ghrelin水平高于健康对照组(P＜0.01);(2)根据APACHE(Ⅱ)评分≥15分及＜15分将患者分为高危组及低危组后，高危组患者血浆活性ghrelin水平高于低危组(P＜0.05);(3)危重症患者血浆活性ghrelin水平与体质量指数(BMI)呈负相关呈负相关(r=-0.536，P＜0.01)，与TNF-α、IL-6呈正相关(r=0.275，P＜0.05; r=0.452，P＜0.01)。多元线性逐步回归分析提示IL-6是影响血浆活性ghrelin水平的独立相关因素。　　 结论：活性ghrelin在危重症患者外周血中高表达，可能与危重症状态下营养不良及高炎性反应有关，其浓度值的测定有助对病情危重程度的评估。