Musashi-2与AML临床预后关系及在Hl-60细胞生物学中的作用研究

来源 :温州医学院 温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sanshao
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目的:通过检测AML初诊患者Msi2 mRNA表达,结合患者随访,采用独立样本t检验分析Msi2表达与AML和AML预后的关系,探讨其是否是一个较佳的早期预后指标。采用基因工程方法,构建Msi2-pIRES2-EGFP质粒,转染人髓系白血病HL-60细胞株,观察Musashi-2对HL-60细胞细胞生物学性状的影响。  方法:(1)提取临床初诊确诊为AML的患者和按时随访的AML患者的骨髓标本的总RNA,荧光定量RT-PCR检测患者Msi2的表达水平,综合分析其它实验室检查和患者的临床表现,结合患者随访,分析Msi2表达与患者预后的关系,探讨是否是一个较佳的预后早期预测指标;(2)从HL-60细胞株中提取总RNA,经RT-PCR扩增出Msi2模板基因,酶切后插入真核表达载体pIRES2-EGFP得到Msi2-pIRES2-EGFP重组真核表达载体,酶切后测序鉴定。测序鉴定成功后经LipofectamineTM2000脂质体介导重组质粒转染NIH3T3细胞,荧光定量RT-PCR和蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测NIH3T3细胞转染后Msi2mRNA和蛋白表达;(3)用LipofectamineTM LTX转染试剂介导重组质粒转染HL-60细胞株,72小时后荧光定量RT-PCR和Western blot检测Msi2 mRNA和蛋白表达,MTT法检测细胞增殖能力的改变。  结果:(1)初诊AML患者骨髓Msi2表达显著高于正常对照骨髓(P<0.05),各亚型中Msi2表达以M1和M5表达为高,显著高于AML其它亚型(P<0.05);(2)AML患者中Msi2表达高者预后差(P<0.01)(3)酶切及测序结果证实Msi2-pIRES2-EGFP重组真核表达载体构建成功;(4)将此重组质粒转染至NIH3T3细胞,72小时后收集总RNA和蛋白,荧光定量RT-PCR和Western blot都证实重组质粒在基因和蛋白水平都能有效表达;(5)转染重组质粒的HL-60细胞Msi2表达较对照组和空质粒组有显著增加(P<0.01)(6)MTT法检测细胞增殖能力显示转染重组质粒的HL-60细胞较对照组和空质粒组其增殖能力增强(P<0.05)。  结论:(1)人AML初诊患者Msi2表达显著高于正常人,且M1和M5亚型显著高于其它亚型;(2)Msi2表达高的患者预后不良;(3)成功构建融合蛋白表达载体Msi2-pIRES2-EGFP,并转染至NIH3T3细胞,成功检测到Msi2基因和蛋白表达;(4)重组质粒转染至HL-60细胞后导致Msi2基因过表达,引起HL-60细胞增殖能力增强。
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