背景八味冠心宁胶囊是河南省焦作市温县第二人民医院的自制制剂,处方中含红花、瓜蒌、沉香、川芎、降香、丹参、赤芍和三七八味中药。具有宽胸理气,活血祛瘀的作用。临床上主要用于治疗胸痹之气滞血瘀,胸阳痹阻型,即通常所说的冠心病。自2004年审批并开始销售以来,疗效确切,在当地拥有很好的市场。相对与普通药物,医院自制制剂虽然市场较小,使用范围有限,但由于其价格适中,新农合医保报销比例较高,中药毒副作用相对较小以及使用方便等特点,使得其在当地拥有较为广阔的市场。与销售良好的药品相比,现有的医院制剂标准都是上世纪所制定,方法简单、项目相对较少,不足以满足现阶段国家提倡的对药品质量严格控制的现状。为提高现有八味冠心宁胶囊质量标准的水平,本课题以羟基红花黄色素A为考察对象,拟采用现阶段技术较为成熟、运用较为广泛的高效液相色谱法对八味冠心宁胶囊进行定量分析,从而对该药品的质量加以控制。并在此基础上对该药的的部分药理作用进行了考察。目的本研究对八味冠心宁胶囊重要组成红花中羟基红花黄色素A含量的测定方法进行了方法学考察,建立了高效液相色谱法测定该成分含量的方法,从而对该药品的质量进行控制。此外,通过测定SD大鼠用药前后血清总胆固醇的变化,探讨了该药对血清总胆固醇水平的影响。方法1.分别从精密度、重复性、稳定性三方面对红花中羟基红花黄色素A含量的测定方法进行方法学考察。2.建立高效液相色谱法测定八味冠心宁胶囊中羟基红花黄色素A的含量:(1)通过紫外分光光度计法,确定检测波长;(2)通过对不同提取溶剂、提取方法、提取时间的正交试验考察,确定最优的样品处理方法;(3)分别从专属性、线性关系、精密度、重复性、稳定性和加样回收率方面对所建立的方法进行考察。3.探讨八味冠心宁胶囊对血清总胆固醇水平的影响:(1)建立模型:24只SD大鼠随机分为四组:对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组6只,采用单色苦味酸溶液对大鼠进行染色编号。正常饲料喂养3天后尾静脉采血0.5ml置于肝素化离心管中,2000 r/min离心10 min,取上清液,高铁-醋酸-硫酸显色法测定血清中总胆固醇(TC)含量。第四天开始每天下午6点给予胆固醇高脂饲料喂养持续喂养一周后同法测定血清TC值,并对数据结果进行分析。(2)给药:对照组大鼠给予正常高脂饲料;其余三组用少量鼠饲料蘸取八位冠心宁胶囊内容物进行投喂(低、中、高三组饲料中分别混合八味冠心宁胶囊内容物0.6 g、1.2 g和1.8 g),用少量鼠饲料蘸取八味冠心宁胶囊内容物进行投喂,确保每只大鼠摄取定量药物后放回笼中自由饮食。(3)采血:分别于给药后第3天、第6天、第9天、第12天、第15天在给药前尾静脉采血1次,分离血清,测定其TC值,结果采用SPSS25.0统计软件进行分析。结果1.红花中羟基红花黄色素A含量测定方法学考察:羟基红花黄色素A在该条件下理论塔板数大于3000,分离度大于1.5,符合药典对该项目的系统性试验要求。精密度考察中6次羟基红花黄色素A的峰面积平均值为2922268,RSD为0.55%,精密度良好。重复性考察中,6份样品保留时间的平均值为8.984,RSD为0.22%,重复性良好。稳定性考察中,计算7个时间点样品保留时间的平均值为8.991,RSD为0.46%;峰面积的平均值为2914772,RSD为0.30%,表明该方法在24 h内测定结果稳定。2.建立新的八味冠心宁胶囊含量测定方法:(1)色谱条件:色谱柱为Thermo C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26:2:72,v/v),检测波长:403 nm,柱温:30℃,流速:1.00 ml/min,紫外检测器。(2)样品处理方法:选择25%的甲醇溶液作为溶剂,超声处理30 min作为样品提取方法。(3)方法学考察:对建立的高效液相方法,结果显示羟基红花黄色素A在0.02625～0.4200μg范围内呈良好的线性关系(r=0.99999)。精密度考察计算6次羟基红花黄色素A的峰面积平均值为823.7,相对标准偏差为0.47%,精密度良好。重复性考察中,6份样品含量的平均值为0.4371mg/g,RSD为0.58%,重复性良好。稳定性考察中,计算7个时间点样品峰面积的平均值为833.7,RSD为1.2%,表明该样品在24 h内测定,结果稳定。计算羟基红花黄色素A的平均加标回收率为98.78%,RSD为0.59%,该方法回收率良好。3.八味冠心宁胶囊对血清总胆固醇水平的影响:(1)高脂饲料喂养后大鼠血清总胆固醇(TC)水平明显升高,进行配对样本t检验,t=-33.415,P=0.000,统计学上有显著性差异,建模成功。(2)4组SD大鼠15天前后6个时点血清中TC值变化的多变量检验结果显示:6个时点的TC值有显著性差异,F=3.235,P=0.001<0.05,说明时点与组别交互效应显著。结论红花中羟基红花黄色素A的含量测定方法有良好的重现性、稳定性,可以为八味冠心宁胶囊含量测定方法的建立提供有力的技术支持;所建立的高效液相色谱法对八味冠心宁胶囊中羟基红花黄色素A的含量测定方法重现性好,稳定性强,并且简便、准确、运用方便,可用于对八味冠心宁胶囊的质量进行控制。通过动物实验,可以发现八味冠心宁胶囊可明显降低SD大鼠血清总胆固醇(TC)水平,呈剂量依赖性。