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研究背景:神经病理性疼痛是神经系统损伤引起的一种慢性疼痛,其发病机制复杂,至今尚缺乏有效的治疗药物。传统的疼痛治疗法主要是针对神经元,但研究表明胶质细胞在慢性疼痛中起着至关重要的作用。因此,疼痛治疗更合适的靶点可能是神经胶质细胞。P2X4受体属于嘌呤能受体家族的成员之一,脊髓背角(SDH)小胶质细胞及背根神经节(DRG)的卫星胶质细胞(SGCs)内表达P2X4受体,神经病理痛上调SDH小胶质细胞与DRG的SGCs表面P2X4受体,同时促进初级感觉神经元释放的ATP激活P2X4受体,并使SGCs和小胶质细胞释放生物活性分子进而增加DRG或脊髓背角神经元的兴奋性,增强神经病理痛的信号传导。紫云英苷(Astragalin,AST)具有抗炎、抗氧化等多种药理作用,结合我们预实验观察到神经病理痛大鼠在应用紫云英苷后大鼠痛行为减轻,因此,我们推测紫云英苷可能具有抗伤害、镇痛作用。目的:本研究通过建立坐骨神经慢性压迫性损伤(Chronic constriction injury,CCI)神经病理性疼痛大鼠模型,探索紫云英苷是否可通过影响脊髓背角和背根神经节P2X4受体的表达及功能,从而减轻神经病理痛模型大鼠的痛行为。观察AST对CCI大鼠的影响,探索其可能的机制,有利于拓宽和深化对AST作用和机制的认识,为防治神经病理痛探索新的方法。方法:本实验首先建立CCI大鼠神经病理痛模型,并将SD大鼠随机分为六组:正常组(Ctrl组)、假手术组(Sham组)、模型组(CCI组)、正常+紫云英苷组(Ctrl+AST组)、模型+紫云英苷组(CCI+AST组)、模型+药物溶剂组(CCI+DMSO组)。(1)行为学测定:通过足底机械缩足反射阈值(Mechanical withdrawal threshold,MWT)、热缩足反射潜伏期(Thermal withdrawal latency,TWL)检测大鼠痛行为的变化;(2)通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)检测各组大鼠背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)以及脊髓背角(Spinal dorsal horn,SDH)中P2X4的mRNA变化情况;(3)通过蛋白印迹(Western blot,WB)检测P2X4、肿瘤坏死因子受体-1(TNF-R1)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、OX-42、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2及磷酸化(p)-ERK1/2蛋白的表达变化;(4)通过免疫荧光双标的方法检测各组大鼠DRG中P2X4受体与GFAP的共表达情况,以及SDH中P2X4受体与OX-42的共表达情况。(5)利用全细胞膜片钳技术观察紫云英苷对转染了P2X4重组质粒的HEK293细胞(Human Embryonic Kidney 293 cell,人胚胎肾细胞293)ATP激活电流的影响。结果:CCI大鼠神经病理痛模型建立成功。(1)紫云英苷减轻CCI模型大鼠痛行为:与Ctrl组相比,CCI组大鼠机械缩足反射阈值(MWT)和热缩足反射潜伏期(TWL)显著降低(p<0.001);CCI+AST组较CCI组明显升高(p<0.001);CCI+DMSO组与CCI组相比无明显差异(p>0.05)。(2)紫云英苷降低CCI大鼠DRG以及SDH中P2X4受体表达。qPCR结果显示:CCI组大鼠DRG以及SDH中P2X4mRNA表达水平均明显高于Ctrl组(p<0.01);CCI+AST组中P2X4mRNA的表达水平较CCI组明显降低(P<0.01);CCI+DMSO组和CCI组无明显差异(P>0.05)。WB结果显示:CCI组大鼠DGR以及SDH中P2X4蛋白表达水平明显高于Ctrl组;CCI+AST组中P2X4蛋白的表达水平较CCI组明显降低(p<0.01);CCI+DMSO组和CCI组相比无明显差异(p>0.05)。(3)紫云英苷抑制CCI诱导的胶质细胞激活。免疫荧光双标结果显示:DRG中P2X4受体与卫星胶质细胞标记物GFAP存在共表达,SDH中P2X4受体与小胶质细胞标记物OX-42存在共表达,CCI组的荧光强度明显高于Ctrl组(p<0.001);CCI+AST组的荧光强度较CCI组明显降低(p<0.001);CCI+DMSO组与CCI组相比无明显差异(p>0.05)。同时观察到DRG中GFAP及脊髓背角OX-42蛋白表达水平在CCI组大鼠增加,应用紫云英苷的CCI大鼠明显下降(p<0.001)。(4)紫云英苷减少CCI大鼠TNF-R1表达:CCI大鼠TNF-R1蛋白表达水平明显高于Ctrl组;CCI+AST组蛋白的表达水平较CCI组明显降低(p<0.01);CCI+DMSO组和CCI组相比无明显差异(p>0.05)。(5)P2X4受体激活涉及ERK信号通路的激活。CCI大鼠p-ERK1/2蛋白表达水平均明显高于Ctrl组;CCI+AST组p-ERK1/2蛋白的表达水平较CCI组明显降低(p<0.01);CCI+DMSO组和CCI组相比无明显差异(p>0.05)。(6)紫云英苷可抑制转染了pEGFP-hP2X4质粒的HEK293细胞的ATP激活电流。结论:紫云英苷可通过降低背根神经节和脊髓背角中P2X4受体的表达,抑制DRG卫星胶质细胞及SDH小胶质细胞的激活,抑制ERK1/2通路的激活,减少TNF-R1的表达,减轻神经元与胶质细胞之间疼痛信号的传递,从而缓解CCI模型大鼠的痛行为。