红花草莓(red-flowered strawberry)是由开白花的栽培草莓(Fragaria×ananassa)与开红花的沼委陵菜(Potentilla palustris)通过远缘杂交方法育成的属间杂种,是草莓家族的新成员,具有很高的观赏价值,同时果实亦可食用,具有很好的发展空间与前景。近几年以来,随着高通量测序技术的发展,可以为红花草莓花瓣呈色的研究机理提供新的思路。红花草莓杂交后代花瓣发生显著的性状分离,后代的花色从白色一直变化到红色,本文以转录组测序分析等手段,以红花草莓品种‘四季红’杂交后代的红色花瓣和白色花瓣为试材,期望从转录水平分析花色的差异。基于前期的研究基础,克隆红花草莓花瓣花青素苷合成途径中关键结构基因和启动子序列,分析不同花色的结构特点,这对进一步了解红花草莓花色调控机制具有重要意义。主要研究结果如下:以红花草莓品种‘四季红’为试材,选取其花瓣发育过程中具有明显颜色变化的三个发育时期,即蕾期(PF_L)、转色期(PF_Z)、大蕾期(PF_D)的花瓣样品,进行高通量测序。通过基因功能注释,筛选花青素苷合成途径的关键结构基因DFR和ANS,根据FPKM值和log2(foldchange),初步筛选3个DFR基因家族成员FpDFR1、FpDFR2、FpDFR3和1个ANS基因家族成员FpANS1。根据TPM值,可以看出这四个基因随着花蕾发育,表达量逐渐增加。以红花草莓莓品种‘四季红’和杂交后代白花‘B1’的盛花期花瓣为材料提取RNA,克隆了4个结构基因FpDFR1、FpDFR2、FpDFR3与FpANS1,其开放阅读框ORF长度分别为1077bp、1050bp、1116bp、1152bp,并分别编码358个、349个、371个、383个氨基酸。结构基因在红白花中克隆序列相似度高达97%以上,且4个结构基因各自均拥有特殊的保守结构域。本文所克隆成功的结构基因FpDFR1、FpDFR2、FpDFR3拥有一个保守的NADPH结合位点、一个底物特异性结合位点这两个特殊结构域;三个DFR基因均属于NADB-Rossmann家族,拥有独特的FR-SDRe元件;FpANS1基因属于PLN03178超家族,具有[2OG-Fe(II)]双加氧酶家族基因保守结构域,具有Fe离子结合位点与α-酮戊二酸的活性位点。根据氨基酸序列比对,FpDFR2第134位氨基酸为天冬酰胺(N),属于Asn型DFR;FpDFR1基因的特异性结合位点为丙氨酸(A),FpDFR3第134位氨基酸为苏氨酸(T),后两者DFR类型均属于非Asn/Asp型。亚细胞定位于细胞核等其他位置蛋白。与其他物种同源性比对结果几乎都与蔷薇科植物同源性最高。对红花草莓杂交后代不同花色、不同发育阶段的花瓣和不同组织部位进行实时荧光定量实验。结果表明,不同组织部位花瓣(Petal)、果实(Fruit)、叶(Leaf)、叶柄(Petiole)、匍匐茎(Runner)中,红花草莓的DFR1与DFR2基因在果实中的表达量最高,DFR3与ANS1基因在花瓣中表达量最高;在不同花色的红花草莓的基因表达分析中,5个花色红色(Red)、深粉(Deep pink)、粉(Pink)、浅粉(Light pink)、白(White)中,基因均在红花中表达量最高,FpDFR1与FpDFR3在浅粉花中表达量最低,FpDFR2在深粉花中表达量最低,FpANS1基因在白色花瓣中表达量最低;在红花草莓3个不同时期的表达分析中,如L(蕾期)、Z(转色期)、D(大蕾期),所有基因在大蕾期(PF_D)表达量是最高的,在蕾期(PF_L)表达量最低,而基因DFR3比较特殊,在转色期表达量最低,说明基因的表达量受到时间或转录因子等多种因素的调控,十分复杂,并不是一成不变的。以红花草莓莓品种‘四季红’和杂交后代白花‘B1’的盛花期花瓣为材料提取DNA,克隆4个基因的启动子序列FpDFR1Q、FpDFR2Q、FpDFR3Q、FpANS1Q。启动子克隆结果表明,除FpANS1Q外,红花与白花中所克隆的DFR启动子序列相同。除FpDFR1Q之外的3个启动子克隆长度均大于2000bp,启动子区域除TATA-box与CAAT-box元件所占比重较大外,还有较多的Box4、G-box、ARE与ABRE等顺势作用元件。通过对克隆启动子的MYB结合位点的分析发现,相同基因启动子红花与白花中MYB的结合位点的数量没有区别,但不同基因启动子间MYB的结合位点的数量有较明显差别,FpDFR2Q的MYB结合位点最多,表达量也最高。