[目的]破骨细胞的形成和分化是机体维持骨稳态的重要环节,也是骨质疏松等病理过程发生的关键因素。研究证明,活性氧(reactive oxygen species,RO S)在破骨细胞分化和骨代谢中具有重要作用。因此,进一步研究阐明破骨细胞中的氧化还原调节及抗氧化防御系统及其在骨质疏松中的作用对骨质疏松等骨骼疾病防治,发展骨代谢疾病治疗的新策略新方法并研究开发以ROS为靶点的抗氧化治疗药物具有重要意义,已成为目前国内外研究的热点和重要的研究方向。我们在破骨细胞中发现了一个过氧化物酶-2 (Peroxiredoxin-2, PRX-2)家族的新成员并将其命名为“巨噬细胞集落刺激因子刺激的单核细胞中活化的过氧化物酶类分子(PRX-like 2 Activated in M-CSF stimulated Monocytes, PAMM) ",其序列与PRXs相类似且都含有许多氧化还原酶的共同结构特征——CXXC结构,表明PAMM可能是一种具有氧化还原活性的蛋白分子。因ROS在破骨细胞分化和骨代谢中的重要意义,我们推测PAMM可能在破骨细胞分化及骨质疏松中发挥重要作用。因此,本研究主要从四个方面展开对PAMM的系统研究阐明：(1) PAMM分子的主要特性及其表达；(2) PAMM在RANKL诱导的破骨细胞分化中的作用；(3) PAMM的抗氧化活性；(4) PAMM在雌激素缺失所致骨质疏松的作用及PAMM在雌激素的骨保护效应中的作用,旨在揭示PAMM是一个能调节破骨细胞分化的氧化还原调节蛋白,为骨质疏松等骨骼疾病防治,发展骨代谢疾病治疗的新策略和新方法和研发以ROS为靶点的抗氧化治疗药物提供干预作用的新的靶分子。[方法](1) PAMM分子的发现及其主要特性的研究：使用微阵列杂交(Microarray hybridization)技术对RANKL刺激的RAW264.7细胞以及M-CSF+RANKL刺激的正常小鼠骨髓单核细胞(BMM)进行全基因组表达进行筛选,发现并命名了PAMM,根据结构特点初步确定其抗氧化功能；获取小鼠主要组织器官蛋白提取物,Western Blot分析PAMM在各组织器官中的表达；转染HEK293细胞’Western Blot检测上清液中PAMM的表达；检测在破骨细胞分化过程中PAMM mRNA (Real Time PCR)和蛋白(免疫荧光和免疫组织化学染色)的表达,以及PAMM在Csf-1突变tl/tl大鼠补充M-CSF前后骨髓细胞中的表达。(2) PAMM对破骨细胞分化的影响：以RAW264.7细胞为基础,建立PAMM稳定转染细胞系PAMM#1和PAMM#2, TRAP染色检测PAMM高表达对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响,并检测在补充H2O2后对破骨细胞分化的影响；Western Blot检测PAMM稳定转染细胞分化过程中NF-κB和c-Jun活性的变化；构建PAMM突变质粒C85G和C88G并转染细胞检测其对破骨细胞分化的影响,确定此过程中PAMM分子中CXXC组件的重要作用。(3) PAMM分子抗氧化功能的研究：MTT法检测PAMM对H2O2诱导的氧化应激下细胞的保护作用；检测PAMM对细胞内GSG/GSSH比值的影响从而确定PAMM的抗氧化功能；以突变质粒C85G、C88G转染及共转染HEK293细胞,通过对细胞内GSH/GSSG的影响,确定CXXC是PAMM分子抗氧化活性的核心所在；在HEK293细胞和人外周血单核细胞(PBMCs)培养中加入H2O2, RT-PCR检测PAMM和Nrf2 mRNA的表达。(4) PAMM在雌激素缺失所致骨质疏松中的作用：以卵巢切除(OVX)小鼠为模型,检测分析PAMM在OVX小鼠及给予雌激素(E2)补充替代治疗的OVX小鼠骨组织中的表达和Akt活性；在M-CSF刺激的人CD14+PBMC中加入雌激素及雌激素受体拮抗剂ICI182780, Western Blot分析PAMM表达情况；在M-CSF刺激的CD14+PBMC中加入特异性的PI3K激酶抑制剂喔曼青霉素(Wortmannin)和Akt/mTOR通路的抑制剂雷帕霉素(Rapamycin),检测PAMM的表达及Akt活性,研究PAMM的表达与AKt信号通路的关系；ELISA检测人脂肪细胞培养上清液中PAMM的表达。(5)计量资料以x±s表示,至少来自三次重复的独立实验。采用SPSS for Windows22.0进行统计分析,应用One Way ANOVA检验及t检验进行多个样本均数间的比较,P<0.05为显著性差异。[结果](1)基因微阵序列分析显示,与未刺激细胞相比,PAMM mRNA在刺激后的RAW264.7和BMM细胞中均有显著上调,分别为1.41倍和1.48倍；其编码的PAMM分子是一个由229个氨基酸组成的PRX-2家族蛋白,并包含一个与硫氧还蛋白(Thioredoxins, TRXs)分子类似的能够催化还原二硫键以改变靶蛋白的氧化还原状态的CXXC结构(半胱氨酸分别是第85和第88个氨基酸),奠定了其作为抗氧化蛋白的结构基础;小鼠肾脏、脑和肝脏等重要组织器官中可检测到PAMM的表达；破骨细胞及M-CSF激活的细胞中也可检测到明显的PAMM表达；转染PAMM质粒后的HEK293细胞上清液中亦可检测到PAMM;Csf-1突变(tl/tl)大鼠骨髓细胞PAMM表达显著降低,补充M-CSF后其PAMM表达回复到野生型大鼠水平。(2) RANKL刺激PAMM稳定转染细胞后,与对照细胞相比,破骨细胞的分化明显被抑制,NF-κB和C-Jun的活性也被抑制；在培养基中加入H202可部分消除PAMM对破骨细胞的抑制作用；突变PAMM分子中的CXXC后,PAMM失去对破骨细胞分化的抑制作用。(3)PAMM稳定转染细胞在H2O2所致氧化应激下的增殖活性比对照细胞明显增加；PAMM稳定转染细胞内GSH/GSSG比值增加,但CXXC突变后,细胞内GSH/GSSG比值明显降低,与对照细胞相似;H202可诱导HEK293细胞和人PBMC中PAMM 与Nrf2 mRNA的表达。(4)OVX小鼠骨密度和骨组织中的GSH/GSSG比值均下降,其骨组织中PAMM的表达和Akt活性增加,雌激素的补充可增强PAMM的表达；雌激素阻断剂可抑制M-CSF诱导的破骨细胞前体细胞中PAMM的表达；喔曼青霉素和雷帕霉素可同时阻断PAMM的表达和Akt的活化；人脂肪细胞可分泌PAMM。[结论](1)我们首次对C10orf58基因的编码产物进行了表达和功能的研究,把它命名为PAMM,属过氧化物酶2类(peroxiredoxin,PRX-like 2)家族,并具有TRX抗氧化蛋白的共同结构：CXXC(半胱氨酸分别是第85和第88个氨基酸)。PAMM mRNA和蛋白在破骨细胞分化后表达明显,并在M-CSF刺激后的破骨细胞前体细胞中表达显著增加,而在RANKL刺激后有所下降。PAMM在小鼠骨、脑、肝、肾中均有表达,是一种具有229个氨基酸的分泌型蛋白。(2) PAMM可抑制NF-κB和c-Jun的活性从而抑制RANKL诱导的破骨细胞分化,且该抑制作用可被H202消除。其分子中的CXXC是PAMM抑制破骨细胞分化的关键,CXXC结构发生突变后,PAMM失去对破骨细胞分化的抑制作用。(3) PAMM具有抗氧化功能,可在氧化应激下保护细胞,升高细胞内GSH/GSSG比值,降低细胞ROS水平,其氧化功能亦依赖于蛋白分子中的CXXC组成。体内和体外的氧化应激在均可诱导PAMM的表达。突变CXXC后PAMM亦失去抗氧化功能,进一步证实PAMM是通过其抗氧化功能抑制破骨细胞的分化。(4)雌激素可增强卵巢切除(OVX)小鼠骨组织中PAMM的表达,亦可诱导PAMM在破骨细胞前体细胞中的表达；PAMM的表达要求Akt的活化。结合OVX小鼠及体外实验结果,雌激素的骨保护效应的机制之一可能是刺激PAMM的表达而阻止大量破骨细胞前体细胞分化为成熟的骨吸收破骨细胞。人脂肪细胞也可分泌产生PAMM,骨髓中脂肪细胞也可产生PAMM或影响骨质疏松的发生。(5)PAMM作为新发现的Akt调控、可调节破骨细胞分化并参与雌激素骨保护效应的抗氧化蛋白,进一步加深了对细胞氧化应激影响破骨细胞分化和骨代谢机制的认识,有望成为预防和治疗人类骨质疏松的新靶点。