背景：　　香菇（Lentinula edodes）是具有丰富营养价值和药用价值的食用真菌，是全球第二大食用菌，被称作“山珍之王”、“真菌皇后”。香菇具有独特香气和鲜美的味道，被我国最早开发人工栽植，是食用佳肴。我国古代医者即对香菇著有论述，称香菇性平味甘，能够增进食欲、补气益力。现代医学和营养学研究学者也将香菇作为药食同源的重要食材开发研究。　　香菇属于担子菌门伞菌纲伞菌目光茸菌科香菇属。子实体较大，肉厚细密。营养丰富，含有丰富的钙、磷、铁、维生素和粗纤维。蛋白含量较高，种类丰富，含有18种氨基酸和30多种酶，其中包括了人体8种必需氨基酸中的7种，能够纠正酶缺乏症、辅助补充氨基酸。据古籍记载，香菇益胃助食、破血治风，预防麻疹痘疮、治疗头晕头痛。现代医学和生物科学研究针对香菇具体成分分解研究发现香菇多糖具有免疫调节能力，能够抗炎抗肿瘤；香菇麦角甾醇能够预防佝偻病；香菇脂肪酸能够降低人体血脂等。此外香菇提取物还在抗辐射、抗衰老、降血压、神经炎、肝炎、动脉硬化预防治疗等方面发挥积极的作用。但对于香菇中蛋白成分的功能性研究较为鲜见。　　香菇C91-3是本课题组在1991年3月从多株香菇中筛选得到的具有抗肿瘤作用的菌株，命名为“香菇C91-3”，C代表China，即中国。通过分析香菇菌丝体发酵液成分，发现发酵液中除含有氨基酸、多糖等组份外，还含有多种蛋白质组分。发酵液经分离后其中的蛋白质成分具有抑制肿瘤生长的作用。为了进一步探索香菇C91-3菌丝体中功能蛋白的活性和作用机制，深入、具体、准确的开展香菇蛋白的抗肿瘤研究，快速获取有抗肿瘤功效的单一蛋白组份，本课题组从基因序列着手寻找功能蛋白，采用SOLEXA高通量测序方法获取香菇C91-3菌丝体的基因序列。通过比对分析筛选出具有抗肿瘤功能潜力的基因开展深入研究。　　目的：　　（1）在SOLEXA高通量测序基础上通过分析比对，筛选出具有AhpC/TSA家族功能域的基因序列Latcirpin-11（Lp-11），利用生物信息学在线软件预测分析Lp-11的结构、功能和活性，评估其开发价值。　　（2）获取Lp-11基因序列，构建原核表达载体诱导表达获取目的蛋白Lp-11蛋白，复性纯化。　　（3）依据生物信息学预测分析结果对其进行生物学功能验证。　　方法：　　（1）在SOLEXA高通量测序的基础上，通过比对分析筛选出具有AhpC/TSA家族功能域的基因序列Lp-11。采用多种在线预测分析软件，如NPS@:SOPMA secondary structure prediction、Swiss-Model、通过Pfam数据库比对分析等对Lp-11基因序列、蛋白序列、蛋白结构进行分析预测，分析其结构稳定性，以此为基础再通过InterPro、CBS、Bioinfo、TargetP、Propen等软件对Lp-11蛋白活性效应、功能注解进行全面分析，评估Lp-11基因序列功能活性研究潜力。　　（2）采用RACE方法获取Lp-11基因片段，通过大肠杆菌表达系统的pET系统，构建重组质粒pET32a（+）-Lp-11，转化到E.coli.Rosetta-gami(DE3)中，IPTG诱导表达获得包涵体蛋白，经2M尿素洗涤、8M尿素溶解后，通过尿素梯度复性方法使蛋白重新折叠，恢复空间结构；利用His标签采用镍柱亲和层析方法对蛋白进行纯化，获取Lp-11蛋白并采用Weastern Blot和圆二色谱分析法进行鉴定。　　（3）Lp-11蛋白的活性鉴定。通过标记异硫氰酸荧光素（FITC）检测Lp-11蛋白的细胞分布情况；采用1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基（DPPH）实验和DCFH-DA荧光染料检测Lp-11蛋白在细胞外和细胞内清除自由基的能力；通过检测Lp-11蛋白作用后细胞中超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽还原酶活性、总抗氧化能力和过氧化氢含量判断Lp-11蛋白的氧化还原能力；通过Cell Counting Kit-8（CCK-8）检测Lp-11蛋白对细胞生长的调节作用；通过光镜观察细胞生长状态、透射电镜观察细胞用药前后亚微结构的变化、Hoechst33258荧光染色后荧光显微镜观察Lp-11蛋白作用后细胞核的改变；采用Annexin V-FITC/PI染色，利用流式细胞仪分析细胞凋亡状态；通过流式细胞术PI单染对细胞的周期改变进行分析；通过JC-1在不同电位下多聚体与单体之间的变化导致荧光变化来分析细胞在药物作用前后线粒体膜电位变化；通过酶标仪检测Lp-11蛋白作用前后，细胞中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的变化；采用Weastern Blot方法分析细胞中Bcl-2家族蛋白含量的变化；通过ELISA法检测细胞中和线粒体中细胞色素C的变化。　　结果：　　（1）生物信息学分析Lp-11蛋白结构具有空间稳定性，能够进入细胞，在胞浆中分布。具有线粒体相关信号肽以及7个蛋白结合位点和一个核酸结合位点。具有类似于AhpC/TSA家族的功能域，具有脱氢还原的能力。Lp-11蛋白具有深入研究价值。　　（2）成功获取Lp-11基因片段，构建重组质粒pET32a（+）-Lp-11后转化到E.coli.Rosetta-gami(DE3)中经IPTG诱导表达获得包涵体蛋白，尿素洗涤溶解后梯度复性、镍柱亲和层析纯化，圆二色谱分析鉴定成功获得具有空间结构的Lp-11蛋白。　　（3）Lp-11蛋白能够进入细胞，分布在胞浆中，具有提高细胞内氧化还原酶活性和总抗氧化能力的功能，同时能够有效清除细胞中的活性氧自由基。对多种肿瘤细胞具有抑制生长的作用，其中U937细胞的抑制生长率最高，但对正常细胞具有促进生长的作用。通过线粒体途径诱导U937细胞凋亡。　　结论：　　（1）香菇C91-3菌株中具有AhpC/TSA家族功能域的Lp-11基因从结构和功能的预测分析初步判断Lp-11蛋白具有抗氧化、抗肿瘤功能。　　（2）通过RACE、原核表达、复性纯化能够获得具有空间结构的Lp-11蛋白。　　（3）Lp-11蛋白具有氧化还原活性，通过线粒体途径诱导肿瘤细胞U937凋亡，保护并促进正常细胞Huvec的生长。