目的基因组测序发现,在哺乳动物的基因组中,单拷贝基因内和基因之间散布着大量的转座子,这些转座子曾经被认为是无用的“垃圾序列”。这些转座子中最有代表性的就是LINE-1(long interspersed nuclear elements 1,长散布重复序列1,简称L1)。L1是人类基因组中含量最多的自主性逆转录转座子,约占人类基因组DNA的17%。哺乳动物基因组中约1/3的成分都直接或间接跟L1逆转录转座有关。L1有2个开放读码框(opened reading frame),编码2种蛋白质:ORF1——编码的蛋白有RNA结合活性,ORF2——编码的蛋白有核酸内切酶和逆转录酶两种活性,2种蛋白都是L1转座所必需的。迄今为止已发现L1与多种生物学现象关联,包括基因突变, X染色体失活,基因重排,基因表达沉默,肿瘤发生,生物进化等。在机体免疫系统中,T细胞和B细胞抗原受体等位基因排斥,IL-2、IL-4的基因表达都与L1有关。最近,已有研究表明:L1序列能够下调基因的表达——Han将L1.2的ORF2(L1重复序列的一部分)和LacZ分别插入到GFP报告基因下游。与插入LacZ的序列比较,ORF2显著减少GFP蛋白质的产生,使GFP的RNA生成量减少70倍。当改变下游插入片段ORF2的读码框时,GFP的表达仍然受到相同的抑制作用。Han同时还观察到,插入反义ORF2也抑制GFP RNA和GFP蛋白质的产生,但是作用较弱。已知L1有10个家族,根据其ORF2和3’非翻译区同源性进行分类,这10个家族又可以分为75种亚家族,各个亚家族之间存在序列上的差异。因此,上述L1序列下调基因表达的结果是否对其它L1亚家族也是如此,尚未得知。更兼最近还有文献报道,在GFP-L1转基因小鼠中,GFP报告基因可以在小鼠睾丸中表达,但是在其它组织不表达,很明显L1成分参与调控基因表达在不同的细胞中也不相同。因此,有必要研究L1序列参与调控基因表达的不同影响因素。为此,本文拟用L1PA3(L1序列的一个亚家族)序列上的ORF2为研究对象,从ORF2调节基因表达的角度出发,揭示L1序列调控基因表达的影响因素,为进一步探讨L1下调基因表达的潜在机制,提供实验依据。方法1按照引物设计原则,设计目的序列的引物,采用PCR技术,扩增目的序列作为插入片段。在引物中加入合适的酶切位点,根据实验需要采用双酶切或单酶切。2选择pEGFP-C1作为载体,先将载体和插入片段用相同的限制性内切酶酶切,然后用T4 DNA连接酶连接。转化DH5α菌株,PCR法筛选阳性克隆,进一步用酶切和测序鉴定。3用LipofectamineTM2000将重组质粒瞬时转染HeLa细胞。荧光显微镜下计数GFP荧光阳性细胞数,在白光下计数同样视野的细胞总数(每个样本至少500个),计算荧光阳性细胞百分率。在白光和荧光下分别对同一视野照相。结果1重组质粒鉴定将PCR扩增的ORF2正、反序列插入pEGFP-C1质粒,经限制性内切酶(XhoⅠ和PstⅠ)消化鉴定和测序分析,成功构建了重组质粒p-ORF2,p-ORF2as。将PCR扩增的LacZ正、反序列插入pEGFP-C1质粒,经限制性内切酶(XhoⅠ和PstⅠ)消化鉴定和测序分析,成功构建了重组质粒p-LacZ,p-LacZas。将PCR扩增的ORF2/A(ApaⅠ酶切)和ORF2/Am(ApaⅠ酶切,读码框改变)的反序插入pEGFP-C1质粒,经过测序分析,成功构建了重组质粒p-ORF2as/A,p-ORF2as/Am。将PCR扩增的SV40 polyA反序插入p-ORF2as/Am质粒ORF2as/Am片段上游的PstⅠ酶切位点,经过测序分析,成功构建了重组质粒p-Aas-ORF2as/Am。2插入ORF2和LacZ正、反序对GFP基因表达的影响在pEGFP-C1质粒GFP基因下游按正、反方向插入ORF2和LacZ,共有p-ORF2,p-ORF2as,p-LacZ,p-LacZas四种重组质粒,用pEGFP-C1作为对照,转染HeLa细胞,荧光显微镜观察,转染细胞的荧光细胞阳性率为: p-ORF2(0.53±0.10)% p-ORF2as(2.28±0.66)% p-LacZ(1.82±0.31)% p-LacZas(1.07±0.33)% pEGFP-C1(23.88±0.93)%3插入ORF2as/A,ORF2as/Am及polyAas-ORF2as/Am对GFP基因表达的影响以ORF2as为主要研究对象,先将改变酶切位点的ORF2as/A片段插入pEGFP-C1质粒GFP基因下游,构建p-ORF2as/A。再改变ORF2as/A片段的读码框,构建p-ORF2as/Am。最后在ORF2as/Am上游插一段polyAas,构建p-Aas-ORF2as/Am。连同p-ORF2as、pEGFP-C1共5种质粒,转染HeLa细胞,荧光显微镜观察,转染细胞的荧光细胞阳性率为: p-ORF2as(2.5±0.92) % p-ORF2as/A(10.6±0.65)% p-ORF2as/Am(0.39±0.10)% p-Aas-ORF2as/Am(12.53±0.87)% pEGFP-C1(24.13±1.43)%4荧光表达分析(1) p-ORF2(0.53±0.10)%,p-ORF2as(2.28±0.66)%,p-LacZ (1.82±0.31)%和p-LacZas(1.07±0.33)%的荧光细胞阳性率明显低于对照pEGFP-C1(23.88±0.93)%的荧光细胞阳性率(P<0.01)。(2)转染p-ORF2(0.53±0.10)%的荧光细胞阳性率明显低于p-ORF2as(2.28±0.66)%,p-LacZ(1.82±0.31)%和p-LacZas (1.07±0.33)%的荧光细胞阳性率(P<0.05)。(3)转染p-ORF2as/A(10.6±0.65)%的HeLa细胞荧光阳性率高于p-ORF2as(2.5±0.92)%的荧光阳性率(P<0.01)。(4)转染p-ORF2as/Am(0.39±0.10)%的HeLa细胞荧光阳性率明显低于p-ORF2as/A(10.6±0.65)%的荧光阳性率(P<0.01)。(5)转染p-Aas-ORF2as/Am(12.53±0.87)%的HeLa细胞荧光阳性率明显高于p-ORF2as/Am(0.39±0.10)%的荧光阳性率(P<0.01)。结论1在pEGFP-C1质粒的GFP基因下游插入片段大小相同,但序列不同的DNA片段时,均能抑制上游GFP基因的表达,且不同序列抑制作用的强弱不同,ORF2正序抑制作用最强。2相同的ORF2as片段插入到GFP下游的不同酶切位点,对GFP的抑制作用不相同。3 ORF2as片段插入pEGFP-C1质粒的同一个酶切位点,读码框改变后,GFP基因的表达不同。4 SV40polyA反向插入到改变读码框的ORF2as上游时,可以部分解除ORF2as对GFP基因的抑制作用。