酶固定化技术是化学酶工程一个重要的分支。与传统的自由酶相比,固定化酶具有酶解效率高、酶解时间短、可重复使用并减少酶自身消化等优点。近年来,固定化酶技术在蛋白组学分析,多肽分离与分析等研究中得到了广泛的应用。固定化酶反应器有很多优点,但其性能与固定化的载体材料密切相关。　　本文采用酶固定化技术将酶固定化到不同的载体上,并以黑蚂蚁蛋白、牛血清白蛋白、细胞色素C等为底物,研究固定化酶反应器的酶解性能。主要研究内容如下:　　(1)研究了磁性可再生性固定化酶反应器的制备并应用于微波辅助蛋白酶解。于SiO2包覆Fe3O4的磁性粒子(Fe3O4@mSiO2)表面经2,3-环氧丙基丙基三甲氧基硅烷偶联剂(GLYMO)与亚氨基二乙酸(IDA)反应的产物(GLYMO-IDA)修饰,加入Cu2+形成金属螯合配体后利用Cu2+与木瓜蛋白酶作用固定木瓜蛋白酶。在优化条件下,获得的固定化酶酶活为1158.8 U,酶活保留率达44.1％。所获得的固定化木瓜蛋白酶具有易再生,再生后酶活稳定的特点,再生5次后酶活平均值为1014 U,再生率达88%。HPLC分析表明,微波辅助结合可再生固定化酶可用于黑蚂蚁蛋白的快速酶解。　　(2)研究基于有机-无机复合氨基化硅球大容量可再生固定化酶反应器(IMER)的制备并应用于蛋白的快速和定向酶解。首先,于固相小柱底部制备有机支撑层整体材料。然后将戊二醛激活硅球填充到固相小柱里,并进行胰蛋白酶固定化制备大容量可再生 IMER。以牛血清白蛋白(BSA)为底物来考察 IMER的酶解性能。LC-ESI MS3的多肽丰度及序列分析表明,该 IMER酶解1mg/mL BSA后可以产生特定序列的多肽片段。该 IMER具有良好的重复使用性,在重复10次BSA酶解过程中获得稳定的多肽片段。通过HCl处理打开-C=N-双键并重新进行戊二醛激活和胰蛋白酶的固定化即可容易实现IMER的再生,且再生前后的IMER酶解产生的多肽谱图轮廓非常相似。　　(3)研究了基于聚高内相乳液STY-DVB-PGA多孔整体材料大容量可再生固定化酶反应器的制备,并将获得的 IMER用于蛋白的酶解实验。研究发现在STY-DVB比例为3,分散相体积分数为90%,PGA百分含量为6%的条件下,可制备出高度交联的并具有机械强度好、渗透性高和比表面积大的多孔整体材料。在相对简单的优化条件下,该IMER可以在10 min内有效的酶解BSA,获得高达51%的多肽序列覆盖率。同时,该IMER还具有稳定的重复使用性。通过HCl简单处理即可容易实现IMER的再生,再生后IMER酶解BSA可获得高达47%的多肽序列覆盖率。再生后的IMER具有快速、高效的蛋白酶解能力。