论文部分内容阅读
第一部分支气管哮喘唾液、诱导痰及粪便细菌群谱多样性及相似性分析背景:支气管哮喘是多种炎症细胞参与的气道炎症性疾病,其疾病进程与遗传、环境、机体的免疫状态等因素具有密切的联系,而微生物在其中扮演了重要的作用。随着16s RNA基因测序技术的发展,人们发现健康人口腔、呼吸道及消化道之间的细菌群谱多样性存在差异,而同时它们亦具有不同程度的相似性,表明三者之间细菌存在相互影响。哮喘人群口腔、呼吸道及消化道细菌群谱结构的差异及相似性研究较为缺乏,其与哮喘的关系尚不明确。目的:比较哮喘唾液、诱导痰及粪便之间细菌群谱多样性及相似性。方法:随机入组55例哮喘患者,同时采集唾液、诱导痰及粪便样本进行细菌基因组DNA提取及鉴定。共32例样本经鉴定合格并进行细菌16S r RNA基因V4区的扩增及文库构建。在Miseq250平台(BGI,武汉)对扩增样品进行可逆终止链合成测序。测序所得数据与物种数据库进行比对,行细菌OTU的物种注释,分析唾液、诱导痰及粪便之间细菌群谱多样性及相似性。结果:1.在细菌基本测序数据及OTU统计分析方面,粪便原始读取数及有效读取数均显著高于诱导痰(p<0.05),诱导痰有效读取率同时高于粪便及唾液,而唾液有效读取率则显著低于粪便(均p<0.05)。粪便OTU总数显著高于诱导痰及唾液(p<0.05)。2.在Alpha多样性分析方面,哮喘唾液细菌Shannon指数高于粪便,而诱导痰细菌Simspon指数高于粪便(均p<0.05)。3.在Beta多样性分析方面,粪便与唾液细菌群谱多样性差异最大,其次为粪便与诱导痰,唾液与诱导痰细菌群谱多样性差异最小(R2=0.5081,p<0.001)。4.唾液与粪便细菌相似性指数最高,其次为诱导痰与粪便,唾液与诱导痰细菌相似性指数最低。其中唾液-粪便及诱导痰-粪便、唾液-粪便及唾液-诱导痰之间相似性指数具有显著性差异(均p<0.05)。结论:哮喘唾液、诱导痰及粪便细菌群谱多样性存在差异。同时,唾液、诱导痰及粪便细菌存在不同程度相似性。其中唾液与粪便细菌群落结构及相对丰度综合相似性最高。第二部分诱导痰及粪便细菌群谱与支气管哮喘临床特征的相关性分析背景:人类呼吸道过去被认为处于无菌环境中,而微生物基因检测技术的应用使人们认识到呼吸道内存在大量细菌定植。而大量研究表明,健康人与哮喘患者呼吸道细菌群谱多样性存在差异且其与哮喘临床特征存在明显相关性。而“卫生假说”则提出生命早期消化道细菌群谱多样性的改变可导致成年哮喘发病风险增高。因此呼吸道及消化道细菌群谱的变化与哮喘疾病进程具有密切关系。目前该领域研究多集中与国外哮喘人群,中国人群呼吸道及消化道细菌群谱与哮喘的关系尚不明确。目的:比较哮喘与健康人诱导痰及粪便的细菌群谱的差异及其与哮喘临床特征的相关性。方法:诱导痰检测:随机入选41例哮喘及22例健康人进行细菌基因检测及鉴定。粪便检测:随机入选38例哮喘及24例健康人进行细菌基因检测及鉴定。所有受试者行肺功能、诱导痰、血常规及专项过敏原检测。经鉴定分别有23例哮喘与14例健康人诱导痰样本、29例哮喘与15例健康人粪便样本检测合格并进行细菌16S r RNA基因V4区的扩增及文库构建。在Miseq250平台(BGI,武汉)对扩增样品进行可逆终止链合成测序。测序所得数据与物种数据库进行比对,行细菌OTU的物种注释,分析哮喘诱导痰及粪便细菌群谱多样性与健康人的差异,同时将其与临床指标进行相关性分析。结果:1.诱导痰:(1)临床特征:与健康对照组相比,哮喘组年龄[50.0(40.6,52.3)]、痰嗜酸性粒细胞比率[9.3(11.9,31.7)]、血嗜酸粒细胞个数[0.3(0.2,0.5)]、血嗜酸粒细胞比率[4.6(3.7,7.0)]及总Ig E[172.0(124.8,,486.9)]均明显增高。而FEV1占预计值%(77.4±3.9 vs 94.1)、FEV1/FVC%(68.0±2.3)、FEF25-75占预计值%[36.9(31.6,46.4)]、MEF75占预计值%[50.9(41.5,66.6)]、MEF50占预计值%(39.2±3.8vs 77.1)及MEF25占预计值%[26.4(43.3)]则明显降低。(2)哮喘组及健康对照组诱导痰细菌Alpha多样性指数差异均无统计学意义。(3)在细菌门、纲、目水平上,哮喘组诱导痰梭杆菌丰度均明显低于健康对照组[7.360(5.888,9.758)vs11.437(7.578,21.956),p=0.042]。(4)诱导痰细菌群谱与哮喘临床特征无明显相关性。2.粪便:(1)临床特征:与健康对照组相比,哮喘组年龄(47.7±2.5岁vs 36.1)、诱导痰嗜酸粒细胞比率[12.4(13.2,29.0)]、血嗜酸粒细胞个数[0.3(0.2,0.4)]、血嗜酸粒细胞比率[4.4(3.2,6.5)]及总Ig E[158(89.1,549.9)]均显著增高,而诱导痰巨噬细胞比率[16.6(16.5,34.3)]、FEV1占预计值%(72±3.8vs95)、FEV1/FVC(66.1±2.1)、FEF25-75占预计值%[35.8(28.9,44.6)]、MEF75占预计值%[50.8(40.2,64.2)]、MEF50占预计值%[39(31.1,47.9)]及MEF25占预计值%(34.4±3.3vs77.6)均明显降低。(2)哮喘组及健康对照组粪便细菌Alpha多样性指数差异均无统计学意义。(3)在细菌门水平上,哮喘组粪便柔壁菌丰度明显低于健康对照组[0.004(-0.082,0.709)vs0(-0.003,0.130),p=0.033]。在细菌科水平上,哮喘组粪便毛螺菌丰度显著低于健康对照组(8.883±0.916vs12.005±1.155,p=0.04),而氨基酸球菌丰度则明显高于健康对照组[3.623(1.849,6.872)vs1.382(0.899,4.093),p=0.03]。(4)哮喘粪便中氨基酸球菌科丰度与FEV1(R=0.391,p=0.036)及MEF75%(R=0.658,P=0.001)呈正相关;毛螺菌科丰度与痰嗜酸粒细胞比率(R=-0.420,p=0.019)、血嗜酸粒细胞数(R=-0.465,p=0.013)及吸入性糖皮质激素剂量(R=-0.417,p=0.024)呈负相关。结论:与健康对照组相比,支气管哮喘存在不同的呼吸道及消化道细菌群谱组成,其中消化道细菌群谱与哮喘临床特征相关,而呼吸道细菌群谱与哮喘临床特征则未发现明显相关性。