背景及目的：蛛网膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage，SAH）是最常见的出血性脑血管意外之一，主要为颅内动脉瘤破裂所致。而颅内动脉瘤本身是一种良性疾病，随着神经外科手术和影像技术的发展，颅内动脉瘤瘤体本身可通过外科手术或介入治疗获得治愈，但其伴发的SAH却导致超过40%的患者死残。因此，SAH继发性脑损伤是破裂动脉瘤治疗中的关键环节及研究热点。SAH继发性脑损伤机制的研究已持续了数十年，但迄今尚未被完全阐明。既往大部分研究着眼于SAH后颅内大动脉的痉挛上，但近些年研究显示大动脉痉挛并不是SAH后迟发性神经功能障碍及临床不良结果的主要原因。因此，国际上最近又提出了SAH后“早期脑损伤”理论，认为在SAH后早期（72h内）机体一系列病理过程即已启动。其中，以“皮质播散性去极化（CorticalSpreading Depolarization, CSD）”为代表的神经元兴奋性紊乱在SAH后继发性脑损伤中扮演着重要的角色。“超极化激活/环核苷酸依赖（HCN)通道”最早发现于上个世纪七十年代，三十多年来，其电生理功能的多样性一直吸引着众多科学家对其进行深入研究。近年来，HCN通道在中枢神经系统兴奋性维持中的重要作用备受关注。目前普遍观点认为HCN通道是神经环路兴奋性稳态调控的重要靶点，并将其比喻为神经系统中的“制动器（brake）”。尤其值得注意的是，在某些中枢神经系统疾病（例如癫痫、脑缺血等）中，HCN通道的功能状态变化将直接导致或者参与了相关神经环路兴奋性紊乱的发生。但迄今为止对于HCN通道在SAH后继发性脑损伤中的作用尚缺乏研究。我们推测在SAH后可能存在HCN通道的功能、表达变化，使神经元电活动发生了改变，进而诱导或者参与了SAH后CSD相关疾病现象的发生，并最终造成SAH后继发性神经功能障碍。本课题拟从HCN通道介导的神经兴奋性紊乱的新角度探讨SAH后神经功能损害发生的机制及防治途径，并在更现实的意义上，可能有助于为新的临床药物开发提供实验室依据，改变目前临床SAH后继发性脑损害治疗缺乏有效手段的现状。方法：1.建立线穿法大鼠蛛网膜下腔出血的动物模型，观察其死亡率及蛛网膜下腔出血情况，HE染色观察SAH后不同时间段海马附近脑室血凝块（blood clot）分布情况，常规免疫组化方法观察SAH后不同时间段血红蛋白（Hb）在脑室周围海马脑实质浸润情况；2.应用Western blot及RT-PCR技术检测SAH后不同时间段海马CA1区HCN1型通道的表达情况；3.应用含有氧合Hb的人工脑脊液体外模拟SAH出血环境，全细胞膜片钳技术观察记录脑组织片海马CA1区锥体神经元在血性脑脊液环境下HCN通道电流及神经兴奋性的变化情况。Biocytin标记对脑组织片海马CA1区记录细胞进行形态学鉴定。4.应用“NO试剂盒”检测海马CA1区组织片在血性脑脊液环境下NO释放浓度的变化，全细胞膜片钳技术观察记录脑组织片海马CA1区锥体神经元在分别给予NO释放剂NO/Sp和一氧化氮合酶（NOS）抑制剂L-NNA后HCN通道电流及神经元兴奋性的变化，然后进一步对比比较血性脑脊液环境下海马CA1区锥体神经元分别在上述两者干预后HCN通道电流和神经元兴奋性的变化情况。结果：1. SAH模型动物24h死亡率为38%，假手术组动物24h死亡率为0%。SAH模型动物24h后出血量评分为13±218。HE染色结果显示动物建模后24h及72h海马结构附近脑室有明显血凝块聚集。免疫组化结果显示SAH后早期溶血产物Hb侵入脑室周围海马脑实质，其中SAH后72h时Hb浸润程度明显重于SAH后24h时。2. Western blot结果显示SAH后24h及72h时海马CA1区HCN1型通道蛋白表达水平显著下降。进一步应用RT-PCR手段检测，结果显示SAH后24h及72h时海马CA1区HCN1mRNA水平与对照组相比分别下降了60.7%±5.4%和81.2%±4.1%。3.全细胞膜片钳记录显示海马CA1区锥体神经元具有HCN通道电流特性。给予含有Hb的血性人工脑脊液灌流后，海马CA1区锥体神经元膜电位波动明显，伴有动作电位密集发放。与此同时，记录细胞HCN通道电流幅值显著下降。应用CsCl阻断HCN通道后，CA1区锥体细胞在灌流含Hb人工脑脊液前后神经元兴奋性和HCN通道电流均无明显改变。Biocytin标记显示记录细胞具备海马CA1区锥体神经元特征性形态。4.给予含Hb的血性人工脑脊液灌流1h后，海马CA1区组织片NO释放浓度明显下降，灌流2h、3h、4h后，NO浓度继续缓慢下降，同时伴有CA1区HCN1通道蛋白的表达下降。全细胞膜片钳记录条件下，给予NO/Sp，海马CA1区锥体神经元兴奋性降低，表现为特定膜电位水平下的动作电位发放频率下降，与此同时，记录细胞HCN通道电流幅值较给药前有所增加。相反地，给予L-NNA后,海马CA1区锥体神经元兴奋性升高，同时伴有HCN通道电流幅值减小。更进一步地，Hb血性脑脊液灌流后给予NO/Sp可以部分逆转Hb对海马CA1区锥体神经元HCN通道电流的抑制作用，同时可以有效地下调Hb所致的神经元兴奋性增高。结论：1. SAH后早期血液及其溶血产物在“蛛网膜下腔-脑室”系统内迅速播散，并侵入脑实质；2. SAH后72h内，海马CA1区HCN1型通道蛋白和mRNA表达水平持续下降，此结果表明SAH后的病理环境影响海马CA1区HCN通道的正常表达分布；3. Hb血性脑脊液环境下，海马CA1区锥体神经元的兴奋性和HCN通道电流发生改变。Hb能够显著地抑制HCN通道电流，进而诱导或者参与了SAH后海马CA1区锥体神经元兴奋性紊乱的发生；4. Hb血性脑脊液环境下，脑组织NO含量急剧下降。而通过干预循环脑脊液中NO含量，能够明显地影响海马CA1区锥体神经元的兴奋性和HCN通道电流。此结果表明SAH后溶血产物Hb可能通过耗竭脑组织中的NO，进而使HCN通道功能发生改变，并最终导致了SAH后神经元兴奋性紊乱的发生。