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目的:研究雄激素(简称A)对大鼠急性脊髓损伤(简称SCI)的作用及对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(简称caspase-3)基因表达的影响。
材料与方法:选用68只成年雄性SD大鼠,体重:250±25g,随机分为四组(后三组简称SCI组,后两组简称去势组):1、空白组8只:不切除睾丸,只暴露睾丸,不损伤脊髓,只暴露脊髓;2、对照组20只:只切开双侧阴囊不切除睾丸;3、单侧去势组20只:切开双侧阴囊,切除左侧睾丸;4、双侧去势组20只:切开双侧阴囊,切除双侧睾丸。所有大鼠在经过去势手术后15天,开始进行SCI造模手术。造模方法采用改良的Allen's撞击致伤法,致伤力为30gcf(10g×3cm),造成中度脊髓损伤,致伤脊髓阶段为T9-T10(对应的脊椎阶段为T7-T8),大鼠用10％水合氯醛麻醉,无菌条件下以T7-T8脊椎为中心做后正中切口,咬除T7-T8棘突及椎板,制作SCI模型。各组分别在SCI后4h、12h、24h、3d四个时间点进行脊髓神经功能评价和斜板试验,之后除空白组处死2只大鼠外其余每组处死5只大鼠,用事先配好的多聚甲醛进行心脏灌注取材,标本经梯度脱水,浸蜡,石蜡包埋,制成5微米切片,通过对SCI部位标本进行HE染色观察镜下损伤部位脊髓的病理形态,同时对受损脊髓部位进行免疫组织化学检测脊髓组织中凋亡因子caspase-3基因的表达,观察雄激素对大鼠SCI后的神经保护作用。
结果:
1、脊髓神经功能评价:空白组大鼠神经功能稳定,运动正常;SCI组大鼠SCI后双下肢瘫痪,肌张力低,损伤平面以下各种反射不同程度减弱或消失,排尿需人工按压3次/日。对评分结果进行统计学分析,显示SCI后4h、12h时间点三个SCI组比较差异均无显著意义,但是对照组在SCI后24h、3d时间点评分结果高于两个去势组(对照组1.05±0.683,3.48±0.784:单侧去势组0.78±0.059,1.45±0.064:双侧去势组0.69±0.174,1.42±0.415;有显著统计意义),两个去势组比较差异无显著意义。
2、斜板实验:统计结果分析可以得出:对照组在12h时间点时斜板角度明显好于两个去势组(对照组:40.29±4.33;单侧去势组:24.56±2.44:;双侧去势组:22.27±3.51),但两个去势组相比较差异无统计学意义。
3、组织学观察(HE染色):脊髓损伤典型的病理改变为受伤脊髓组织出血、水肿、坏死、轴突脱髓鞘改变、神经细胞凋亡及炎性细胞侵润和胶质细胞反应等,本试验中三个SCI组均有轴突肿胀、坏死、液化、空腔形成及胶质增生等,但两个去势组较为严重。普通光镜观察结果可见:两个去势组表现为损伤范围固定,损伤段脊髓变细,灰白质界限不清,结构紊乱,有大片出血灶、坏死、囊腔及空洞形成,周围有炎性细胞侵润,大量胶质细胞增生,在白质区仍有部分正常结构;对照组脊髓灰白质界限清楚,结构较完整,有局灶性出血,神经元部分水肿变性,尼氏小体部分消失,轴索水肿。
4、免疫组化结果(caspase-3染色):三个SCI组在SCI后4h时间点,损伤部位开始出现明显表达,伤后12h达到高峰(caspase-3阳性细胞计数个/mm2:对照组20.4±1.9:;单侧去势组28.5±2.2;双侧去势组29.1±1.9),伤后1d开始减少,但仍有表达(caspase-3阳性细胞计数个/mm2:对照组11.5±1.5:;单侧去势组18.6±1.3;双侧去势组18.9±2.1),伤后3天基本上只有微弱的阳性表达。
结论:凋亡是SCI后神经细胞死亡的一种重要方式,雄激素可以抑制大鼠SCI后caspase-3基因表达,从而抑制SCI后神经细胞的凋亡,对损伤脊髓的神经功能有保护作用,这可能是雄激素对SCI具有神经保护的分子机制之一,为雄激素应用于临床治疗SCI提供理论依据。