草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖最重要的鱼类品种之一，位居“四大家鱼”之首。草鱼养殖业在我国农业经济中具有重要的意义。在草鱼养殖过程极易发生病害。对于养殖鱼类而言，免疫防治是控制疾病重要而有效的途径。由于鱼类特异性免疫系统尚不完善，因此非特异性免疫因子在抵抗外来病原的入侵中起重要作用。溶菌酶是生物体内重要的非特异免疫因子之一，在引发和维持机体防御免疫的过程中起重要作用。本实验克隆了草鱼g-型和c-型溶菌酶基因全长cDNA，并用荧光定量PCR方法检测了草鱼正常个体和受嗜水气单胞菌感染后各组织中溶菌酶基因的表达情况，初步评价它们的免疫防御功能。同时应用基因工程技术将两种溶菌酶基因成熟肽cDNA导入原核表达载体获得重组草鱼溶菌酶，并比较二者的活性与抗菌谱，探讨两种草鱼溶菌酶的免疫防御功能，为进一步开展鱼类免疫分子机制的研究奠定基础。 1.草鱼g-型和c-型溶菌酶基因的克隆与序列分析 采用RT-PCR和5’RACE技术分别从草鱼的肝脏组织的法分别扩增出g-型和c-型溶菌酶的3’和5’端序列。mRNA中获得特异性cDNA3’和5’片段，将3’和5’端序列用vector软件拼接获得纯化后克隆到pMD18-T载体中，重组子经测序、和序列拼接，获得草鱼g-型和c-型溶菌酶cDNA。序列分析表明草鱼g-型溶菌酶基因cDNA全长为777bp，包括558 bp的开放阅读框(ORF)，编码185个氨基酸，5’非编码区和3’非编码区分别为107 bp和112 bp。草鱼g-型溶菌酶中存在g-型溶菌酶所具有的3个保守的催化残基(Glu73，Asp86，Asp97)；和其他鱼类一样，草鱼g-型溶菌酶不具有哺乳动物和鸟类所具有的保守的二硫键，表明草鱼g-型溶菌酶是非分泌性蛋白。氨基酸序列同源性分析表明，草鱼g-型溶菌酶与已知的牙鲆、大黄鱼和鲤鱼等鱼类的同源性在55％-79％之间。与斑马鱼的同源性最高，为79％，与大西洋鳕的同源性最低的，为55％。草鱼c-型溶菌酶基因全长cDNA，含438 bp的ORF，编码145个氨基酸，前18个氨基酸残基为信号肽。5’非编码区和3’非编码区分别为75bp和175bp，草鱼c-型溶菌酶中存在着典型的c-型溶菌酶所具有的两个保守的催化位点Glu53(E)和Asp70(D)与8个保守的半胱氨酸Cys(C)。草鱼c-型溶菌酶在101、106、107位置不具有钙结合亚型3个保守的Asp(D)，属于c-型溶菌酶中的非钙结合亚型。氨基酸序列同源性分析表明，草鱼c-型溶菌酶与已知的圆鲆、塞内加尔鳎和鲤鱼等鱼类的同源性在34％-82％之间。与鲤鱼同源性最高，为82％，与奥利亚罗非鱼同源性最低，为34％。 2.草鱼g-型和c-型溶菌酶的组织表达 2.1两种溶菌酶在草鱼正常个体中的组织分布 用荧光定量PCR方法对两基因的mRNA水平的组织分布进行了分析。结果显示在正常草鱼中所检测的11种组织均有g-和c-型溶菌酶基因表达，但二个基因的组织表达量不同，g-型溶菌酶在所检测的各组织中表达量较均一，但与c-型溶菌酶基因相比，大多数组织的表达水平均较低。c-型溶菌酶各组织中表达量差异较大，在头肾中高表达(是脑的444.8倍)。 2.2人工感染嗜水气单胞菌后两种溶菌酶基因在草鱼各组织中的表达 人工感染实验显示，感染嗜水气单胞菌后g-和c-型溶菌酶基因表达均有上调，g-型溶菌酶基因的表达总体上调幅度比c-型溶菌酶的大。在所检测的4种组织中，g-型和c-型两种溶菌酶在肝脏的表达水平升幅最大(分别是对照组的12.6倍和5.2倍)，脾脏和鳃中g-型溶菌酶基因的表达水平也显著性升高。头肾中二种基因表达上调的幅度均较小，g-型溶菌酶在头肾中出现高峰时间的较迟，第7d才达到最高峰，但到14d时仍维持高水平。人工感染结果表明草鱼g-型溶菌酶和c-型溶菌酶均具有抵抗细菌入侵的作用，但二者可能存在着不同的作用机制及功能上的分工。 3.草鱼g-型和c-型溶菌酶基因的原核表达、蛋白纯化及活性检测 将二种溶菌酶基因的成熟肽cDNA分别插入表达载体pET-30c(+)，构建重组His融合表达载体。经转化大肠杆菌、IPTG诱导表达，SDS-PAGE检测到分子量约30 kD和20kD的特异蛋白带，分别与预期的g-型溶菌酶和c-型溶菌酶分子大小相符，表明实验成功获得了两种溶菌酶的融合表达蛋白。 重组蛋白经His Bind柱纯化后，依照比浊法检测其溶菌酶活性。结果显示重组草鱼溶菌酶活力检测显示两种重组溶菌酶对溶壁微球菌和6种水生动物病原菌均具有溶菌活性，但二种重组酶对不同菌的溶菌活性不同。活力检测结果佐证了二种溶菌酶在草鱼体内的免疫防御功能及功能上存在的分工。 小结：本实验克隆了二种草鱼溶菌酶——g-型和c-型溶菌酶，它们均具有相应的酶典型结构特征。两种溶菌酶在正常个体中均具有广泛的组织分布，但组织分布模式不同，g-型溶菌酶各组织表达量均较c-型溶菌酶的低，c-型溶菌酶在头肾中高水平表达，推测c-型溶菌酶是草鱼机体正常情况下的主要免疫防御因子。人工感染细菌后，二个基因的表达均上调，g-型溶菌酶基因上调幅度均较c-型溶菌酶基因的高。二个基因在肝脏的上调幅度均最大，但二个基因在同一组织出现高峰的时间或升高幅度、高水平表达量维持时间等均有所不同。受感染后的基因表达调控以及重组溶菌酶活性检测结果显示草鱼g-型溶菌酶和c-型溶菌酶均具有抵抗细菌入侵的作用，但二者存在着不同的调控机制与作用机制。