论文部分内容阅读
目的：探索缝隙连接蛋白在星形胶质细胞的表达分布特点，并研究Cx43通道蛋白在氧糖剥夺损伤再灌注过程中的表达变化规律。方法：体外培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞，利用GFAP免疫荧光染色鉴定纯度，并通过免疫荧光染色观察Cx43缝隙连接蛋白在星形胶质细胞中的表达规律。将纯化后的星形胶质细胞随机分为正常（对照）组（培养基为含糖EBSS，置于37oC细胞培养箱）、OGD组（培养基为不含糖EBSS，置于缺氧培养箱），氧糖剥夺实验（OGD）1h后，再灌注不同时间点（0h、3h、6h、12h、24h），应用免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法检测对照组和OGD组Cx43缝隙连接蛋白表达。结果：依据文献方法纯化星形胶质细胞，免疫荧光显示Cx43通道蛋白呈点状分布在GFAP阳性的胶质细胞边缘，且在两个细胞间连接处表达较多。与正常组相比，OGD干预1h不会引起星形胶质细胞活力的改变。Cx43缝隙连接总蛋白和Cx43缝隙连接磷酸化蛋白（P-Cx43）的表达在OGD干预后都有所增加。结论：Cx43在星形胶质细胞胞膜上丰富表达。OGD诱导Cx43缝隙连接总蛋白和磷酸化蛋白（P-Cx43）的表达增加。目的：研究氧糖剥夺再灌注后调控Cx43活性对星形胶质细胞活化、增殖以及分泌功能的影响。方法：将原代培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞，随机分为正常（对照）组（培养基为含糖EBSS）、OGD组（培养基为不含糖EBSS）、CBX组（培养基为不含糖EBSS和广谱缝隙连接通道阻滞剂CBX）和MFA组（培养基为不含糖EBSS和相对特异性Cx43通道阻滞剂MFA），正常组置于37oC细胞培养箱，OGD组、CBX组合MFA组置于缺氧培养箱；应用LDH释放试验检测药物CBX和MFA的毒性作用；应用免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法检测Cx43通道抑制剂对OGD后再灌注星形胶质细胞活化的影响；应用BrdU免疫荧光染色检测Cx43通道抑制剂对OGD后再灌注星形胶质细胞增殖的影响；及应用谷氨酸试剂盒检测Cx43通道抑制剂对OGD后再灌注星形胶质细胞分泌功能的影响。结果：与对照组相比，实验所用浓度的缝隙连接通道阻滞剂CBX和MFA不会引起细胞凋亡和坏死；与正常培养条件下星形胶质细胞相比，在单纯OGD再灌注后，其GFAP免疫活性和表达量以及BrdU阳性细胞百分率升高，星形胶质细胞胞体较正常组肥大，突起增多，而OGD后加入CBX和MFA后，其GFAP免疫活性和表达量以及BrdU阳性细胞百分率较OGD组下降明显，星形胶质细胞胞体体积和突起也较OGD组下降明显，和正常组接近；OGD诱导的谷氨酸释放在早期可被CBX和MFA所抑制，但再灌24h无统计学意义。结论：星形胶质细胞Cx43缝隙连接通讯的活性对星形胶质细胞活化、增殖和分泌功能有重要的影响，选择性抑制Cx43通道可明显抑制星形胶质细胞的功能，是潜在的基于星形胶质细胞的脑缺血治疗的靶点。