背景:肺癌目前已成为世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。一项针对中国肺癌分布情况的研究发现,在我国东部地区肺癌的死亡风险明显高于西部地区,城市地区肺癌风险较农村地区风险性更高,其中辽宁为肺癌高发地区,其死亡率达66.3/10万。非小细胞肺癌是肺癌中的主要类型,超过所有肺癌病例的50%,其快速进展、复发和转移是导致治疗效果不理想、预后差的主要原因。随着对肺癌驱动基因研究的不断深入,相应的靶向治疗药物也不断涌现,明显改善了具有相应基因突变患者的预后。但治疗后耐药问题的出现,为这部分患者治疗带来了巨大挑战。因此寻找更多的肺癌治疗靶点,具有重要临床意义。FBXL18 E3泛素连接酶属于F-box E3亚家族成员,通过与SKP1和CUL1结合形成SCF复合体发挥功能,该复合体中FBXL18蛋白通过C端亮氨酸结构域（Leucine rich repeat）与特异性靶蛋白结合,促进靶蛋白的泛素化,从而改变其稳定性、活性等。目前对FBXL18的功能研究很少,其在人体多个组织器官中均有表达,以丘脑下核中的表达量最高。相关研究发现,FBXL18能够促进脑组织中AKT蛋白K63位点泛素化进而诱导AKT自身磷酸化,促进脑胶质瘤的增殖,同时磷酸化的AKT进一步促使FOXO3a磷酸化,下调BCL2L11蛋白表达,抑制细胞凋亡。此外,FBXL18能够泛素化FBXL7并通过泛素-蛋白酶体途径降解,减弱后者对有丝分裂的抑制作用,促进细胞增殖及分化。在家族性帕金森病相关研究中发现FBXL18能够泛素化降解磷酸化的LRRK2,同时防止caspase激活以及LRRK2和PD-linked LRRK2突变体造成的神经细胞死亡。目前FBXL18在肺癌中的功能尚无研究。PTEN蛋白是一种重要的抑癌蛋白,能够有效抑制非小细胞肺癌发生发展中PI3K-AKT信号通路的激活,从而抑制肺癌细胞的增殖和侵袭。对肺鳞癌和肺腺癌的基因表达谱分析结果表明:PTEN基因变异频率位居肺鳞癌基因突变比例中的前十位,而其所在PI3K-AKT通路的异常表达更是肺鳞癌发生发展的重要通路之一。对肺腺癌相关通路分析结果同样发现PI3K-AKT-m TOR通路的激活是肺腺癌发生发展的重要因素。其中,PI3K的激活是导致AKT磷酸化和下游分子m TOR激活的关键分子事件,而PTEN则在该通路激活过程中起到重要的抑制作用。除了基因突变以外,泛素化修饰也是影响PTEN稳定性和功能的重要原因之一。最近的一些研究表明,E3泛素连接酶NEDD4-1、WWP2等能够通过泛素化PTEN,诱导后者进入蛋白酶体降解,下调PTEN蛋白的表达进而影响PTEN功能。前期工作中,我们通过对肺癌的大数据分析发现E3泛素连接酶FBXL18与PI3K-AKT信号通路具有显著相关性,进一步通过ESInetwork预测发现FBXL18可能与其中的PTEN蛋白具有相互作用。探讨FBXL18与抑癌蛋白PTEN是否存在相互作用以及对肺癌细胞增殖迁移影响的机制对FBXL18功能解析及转化应用具有重要的科研及临床意义。研究方法:1、通过生物信息学从转录水平及蛋白水平分析FBXL18基因在肺癌及癌旁组织中的表达情况并对生存率进行分析。通过KEGG通路富集分析,获得FBXL18参与的通路及通路中关键蛋白。利用TCGA转录组与蛋白质组数据库,获得FBXL18与预测通路中关键蛋白数据,分析FBXL18转录及蛋白水平与通路关键蛋白表达水平与生存率的关系。收集辽宁省肿瘤医院胸外科2017年1月-2019年12月行手术治疗的47例肺癌患者,所有患者均未接受术前抗肿瘤治疗。利用Western blot验证FBXL18在癌组织与癌旁组织的表达差异,进一步与生物信息学分析结果相互验证。2、培养人肺癌细胞株A549、H1299、H460和SPC-A1,通过慢病毒介导的RNA干扰技术敲低FBXL18基因表达,通过结晶紫染色、平板克隆试验、MTT法等检测FBXL18对肺癌细胞系增殖的影响;划痕试验检测其对细胞迁移的影响。3、在HEK293T细胞系中,通过S-beads pull down及Western blot实验验证FBXL18与PTEN蛋白相互作用;利用分子克隆技术构建PTEN截短体,通过S-beads pull down及Western blot技术确定与FBXL18相互作用的PTEN结构域;通过上述技术分析FBXL18对PTEN泛素化的调控作用及泛素化PTEN的泛素链结合位点;使用放线菌酮CHX处理细胞并分析FBXL18对PTEN蛋白半衰期的影响;使用蛋白酶体抑制剂MG132处理考察FBXL18泛素化PTEN后是否促进PTEN进入蛋白酶体途径降解;通过血清剥夺与IGF-1处理对比FBXL18对PI3K-AKT信号通路的影响。结果:1、通过GEPIA数据库进行FBXL18基因表达谱分析,结果显示FBXL18在肺腺癌和肺鳞癌组织中基因表达量分别为2.42和2.57,显著高于癌旁组织1.67和1.65;对TCGA数据库中LUAD与LUSC组织及相应癌旁组织中FBXL18转录组表达水平分析发现癌组织中FBXL18 m RNA水平均高于癌旁组织,差异有统计学意义（p＜0.05）,在肺鳞癌组织中差异更明显。通过KM-plotter网站对肺癌数据集进行FBXL18生存率分析,发现FBXL18高表达组的生存率较低表达组显著下降（p=0.00013）;KEGG通路富集分析发现FBXL18在LUAD和LUSC中均与PI3K-AKT信号通路显著相关,GSEA算法结果中PI3K-AKT通路同样满足显著性;对转录及蛋白水平上数据进行分析发现FBXL18高表达同时PTEN低表达时生存率显著降低;FBXL18转录组水平高表达同时磷酸化AKT蛋白水平上高表达时生存率显著降低。2、对47例非小细胞肺癌的癌与癌旁组织分析发现,FBXL18在肺癌组织中表达高于癌旁组织;在A549、SPC-A1细胞系中干扰FBXL18基因表达后显著降低了肺癌细胞的增殖能力,过表达FBXL18促进了肺癌细胞的增殖,干扰后回补表达FBXL18恢复了肺癌细胞的增殖能力。干扰或过表达FBXL18对肺癌细胞的迁移能力未见明显影响。3、通过在HEK293T细胞中共转染FBXL18与PTEN质粒以及单独转染PTEN或FBXL18质粒后进行pull-down实验,并进一步用Western Blot证实,FBXL18与PTEN存在蛋白相互作用;构建PTEN截短体后进一步证实两者相互作用位点在PTEN C-tail结构域中;通过慢病毒介导的RNAi沉默、过表达或沉默后回补FBXL18,并用Western Blot检测PTEN表达水平发现,沉默FBXL18对PTEN蛋白表达无明显影响,沉默后回补表达FBXL18,AKT磷酸化明显上调,同时PTEN表达量略有下调;研究两者相互作用机制发现,FBXL18能够泛素化PTEN且泛素化的PTEN蛋白不进入蛋白酶体降解途径降解;进一步研究发现FBXL18能够使PTEN形成K63位点的多聚泛素化而非K48位点多聚泛素化;通过血清剥夺和血清剥夺后加入IGF-1处理细胞实现抑制和激活PI3K-AKT通路后,通过Western Blot检测p AKT水平,结果发现通路激活时过表达FBXL18组AKT磷酸化水平升高。结论:1、FBXL18在肺鳞癌及肺腺癌的癌组织中表达量高于相应癌旁组织,且高表达组生存率低于低表达组;2、FBXL18高表达同时伴PTEN低表达组患者或FBXL18高表达伴磷酸化AKT高表达组患者生存率更低;3、FBXL18具有促进肺癌细胞增殖的作用;4、FBXL18能够诱导PTEN的K63连接泛素化;5、FBXL18通过泛素化PTEN促进AKT磷酸化参与PI3K-AKT信号通路。