舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus)是一种分布较广、食性杂、危害严重的世界性重要农林食叶害虫。长期以来,舞毒蛾的防治主要依赖于化学农药,化学农药的频繁使用已引起害虫抗性形成、高残留和环境污染等问题。高效、环境友好型防治策略的探寻迫在眉睫。随着分子生物学的快速发展,分子靶标的运用将会促成新的防治害虫策略的形成。理想的分子靶标是参与机体至关重要功能的基因产物,通过干扰这类基因的表达能严重影响害虫正常生理机制,能够成功表达靶标基因的dsRNA的转基因植物使得在野外害虫控制中使用RNAi技术成为可能。本研究以农林食叶害虫舞毒蛾(L,dispar)为对象,利用高通量测序技术,进行了植物源杀虫剂鱼藤酮亚致死剂量处理和对照组转录组中差异表达基因分析,筛选出舞毒蛾体内表达显著下调的超气门蛋白基因(LdUSP)。超气门蛋白(USP)和蜕皮激素受体(EcR)组成的异源二聚体在蜕皮激素信号转导过程中起到至关重要的作用。蜕皮激素和保幼激素共同调节复杂着蜕皮和变态两大生理反应,超气门蛋白基因(LdUSP)在昆虫完全变态过程中的分子作用调控机制中具有重要作用。在杀虫剂鱼藤酮的胁迫下，USP基因表达受到抑制,USP基因可能成为理想靶标基因。本研究利用RNAi技术进行LdUSP基因功能分析,进一步构建LdUSP基因dsRNA植物表达载体,探究转基因植株抗虫性,对于新防治策略的形成具有非常重要的意义。具体研究结果如下:1、采用点滴法测定鱼藤酮对舞毒蛾3龄幼虫12、24、36和48 h致死中浓度LC50分别为14.10、10.44、9.75和9.51 mg/L,且随着作用时间的增加鱼藤酮毒性越大。根据毒力测定结果,计算出亚致死剂量并利用其处理舞毒蛾幼虫。结果表明,鱼藤酮对舞毒蛾 3 龄幼虫 12hLC10、LC20、LC30、LC40分别为 3.80、5.96、8.24 和 10.88mg/L;24h LC10、LC20、LC30、LC40h分别为 3.61、5.20、6.76 和 8.47 mg/L;36 h LC10、LC20、LC30、LC40分别为 3.15、4.65、6.14 和 7.80 mg/L;48 h LC10‘LC20、LC30、LC40分别为2.83、4.29、5.79和7.48 mg/L。低剂量鱼藤酮药液对舞毒蛾幼虫生长具有抑制作用。2、采用IlluminaHiSeq2500高通量测序,分别构建鱼藤酮(4mg/L)和对照组舞毒蛾3龄幼虫转录组,获得10.23Gb数据,组装共得到103492条Transcript和74772条Unigene,长度大于 1 kb 为 12239 条。Transcript 与 Unigene 的 N50 分别为 1976 和1146。在4 mg/L鱼藤酮胁迫处理和对照组的差异表达分析中获得差异表达基因710条,其中下调基因325条,上调基因有385条,注释到COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot和Nr数据库中共有576条,对应的各功能数据库基因数分别为222、257、160、352、449、404和548条。注释到GO数据库的差异表达基因257个,其中注释到细胞成分、分子功能、生物过程的差异表达基因数分别为107、212和188;注释到COG数据库的222个差异表达基因中,General function prediction only功能基因最多,含67条。3、在舞毒蛾转录组文库分析基础上,利用RT-PCR技术克隆获得LdUSP基因cDNA全长序列。对舞毒蛾LdUSP基因全长cDNA及其推导氣基酸序列分析表明LdUSP基因阅读框(ORF)长1395bp,含464个氨基酸,该蛋白中相对含量最多的氨基酸是亮氨酸(leu)、丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg),分别含有53、39、37个,分别占总氨基酸数11.4%、8.4%、8.0%。舞毒蛾LdUSP基因属于核受体家族成员,舞毒蛾LdUSP蛋白不含信号肽序列,具有亲水性。多序列比对结果显示该蛋白拥有典型的核受体特征和结构单元(A/B,C,DandE/F结构域)。系统进化树分析表明,舞毒蛾LdUSP蛋白氨基酸序列与已经报道的麟翅目昆虫基因序列相比,均具有较高的同源性,舞毒蛾LdUSP与小地老虎USP(Agrotis ipsilonAGA17964.1)亲缘关系最近。4、采用RT-qPCR法分析LdUSP基因在舞毒蛾3龄幼虫期的时空特异表达及在发育过程中的表达特异性,结果显示，LdUSP mRNA在舞毒蛾3龄幼虫期的0-48 h阶段内表达水平较高且比较稳定,在60-108 h表达起伏相间波动较大,在整个3龄期表达最高峰出现在72 h,差异显著;LdUSP基因在各个发育期均有表达,且不同龄期间具有差异性,舞毒蛾LdUSP基因在雄虫中的表达量最高,在卵、预蛹和蛹期表达量较低。RT-qPCR检测结果显示,舞毒蛾LdUSP基因在胸和腹部的表达量高于头部,在胸部表达量最高。采用RT-qPCR法分析LdUSP基因对植物源杀虫剂鱼藤酮的胁迫响应,结果显示,在4、10、20 mg/L的鱼藤酮剂量处理后舞毒蛾Ld USP基因表达显著下调,且随鱼藤酮浓度增加,其抑制效果加强。5、通过PCR法克隆获得舞毒蛾LdUSP基因的三个片段序列,其中LdUSP-1大小为508 bp(位于 447bp-954bp)，LdUS-大小为 514 bp(位于 806bp-1320bp),LdUSP-3大小为477 bp(位于52bp-528bp)。RNAi技术将舞毒蛾LdUSP基因特异的dsRNA(dsRNAUSP-1、dsRNAUSP-2和dsRNAUSP-3)通过取食导入舞毒蛾3龄幼虫体内获得基因沉默舞毒蛾,测定取食dsRNA 12、24、36、48、72 h后靶标基因mRNA的相对表达量。研究结果显示:通过取食dsRNA可以有效的沉默LdUSP基因,dsRNAUSP-3沉默效果最好。实时荧光定量PCR技术分别分析了 dsRNAUSP-1,dsRNAUSP-2,dsRNAUSP-3对舞毒蛾蜕皮激素应答相关基因(E74、E75、FTZ-F1)和能够编码蜕皮激素合成酶的Halloween基因(Shd、Sad、Phm)表达量的影响,结果显示,取食dsRNAUSP-1,dsRNAUSP-2,dsRNAUSP-3 后基因E74、E75、FTZ-F1、shd、Sad 和Phm的表达均显著下调,说明LdUSP基因对蜕皮激素应答相关基因具有直接或间接性的调控作用,并对Halloween基因具有直接或间接的反馈调节作用。舞毒蛾3龄幼虫摄取dsRNAUSP-l和dsRNAUSP-2后,舞毒蛾3龄历期分别缩短了 0.72和0.83 d,而摄取dsRNAUSP-3使得舞毒蛾3龄历期延长0.32 d。与对照组(RNase-free water)相比,连续取食2 μg/d dsRNAUSP-3 8天后,舞毒蛾3龄幼虫鲜重持续逐减,变化不显著,但幼虫累计死亡率(46.67%)明显高于对照组(13.33%)。6、基于转基因杨树技术成功构建了表达LdUSP基因dsRNA的植物表达载体,并获得转基因84K杨。转基因植株抗虫性结果显示,舞毒蛾3龄幼虫取食转基因84K杨树叶片后,通过RT-qPCR检测发现取食12、24、36、48和72h后幼虫体内目标mRNA表达水平均有不同程度的下降。舞毒蛾3龄幼虫连续取食转基因植株叶片6d,幼虫鲜重有所减轻,但差异不显著。未发现明显的表型异化,具有死亡现象,转基因处理组死亡率为16.67%,对照组死亡率为3.33%。以上结果表明舞毒蛾LdUSP基因能够对杀虫剂鱼藤酮的胁迫产生响应,RNAi介导LdUSP基因功能分析表明LdUSP基因对蜕皮激素应答相关基因具有直接或间接性的调控作用,并对Halloween基因具有直接或间接的反馈调节作用。该基因的沉默虽然没有引起幼虫鲜重的变化,但是能够造成幼虫存活率的降低。表达LdUSP基因dsRNA的转基因植株物能够降低舞毒蛾体内靶标基因的mRNA水平,具有一定的抗虫性,为开辟新的舞毒蛾防治途径奠定了理论基础。