背景与目的：　　准确推断死亡时间(Postmortem Interval,PMI)一直是法医鉴定的重要课题。本实验建立在不同环境温度条件下，应用GC-MS检测尸体脾组织氨基酸等降解产物的含量变化，获得相应物质的代谢规律，筛选与PMI相关性好的标志物及其组合性推断PMI方程。　　材料与方法：　　1、材料：汕头市屠宰场放血处死的健康家猪(4月龄)，平均重145.5 kg，提取完整脾脏，分别置于15℃、25℃、30℃和75％恒温恒湿-昼夜光照12 h的人工气候箱，3个温度组分别0h~156h、0 h~132 h、0 h~108 h每隔12 h取材/14个时间点组、12个时间点组、10个时间点（n=8/组）。其中25℃组另取材，同时进行组织形态量化病理学分析。　　2、检材处理：剪取去被膜脾实质0.1g，加1 ml80%乙醇(1:10 M/V)，匀浆后固定72 h，盐酸酸化-萃取，离心，取上清，沉淀物二次提取离心，取上清置前一管混匀，加乙腈祛蛋白，离心取上清，加内标，吹干、待衍生化。　　3、正交试验优化考察：采用正交设计方法，优化微波辅助衍生化的操作参数，SPSS17.0自动生成正交表L16(44×23)，衍生化效率有较大影响的3个因素(每个因素2~4水平)：溶媒(乙腈、吡啶)，功率(低火、中火、中高火、高火)，时间(1、2、3和4 min)进行考察，取1μL检测。　　4、方法学考察：线性、仪器及制样精密度、重现性及稳定性试验。　　5、形态学及量化病理学：拍照固定大体，Photoshop CS5读取各组照片RGB四个通道均值；取材常规HE切片染色及We igert氏间苯二酚品红染色(弹力纤维染色)，观测各组织形态变化，采用Image-Pro Plus6.0量化分析组织间隙、核总面积及IOD等指标。　　6、统计分析：数据分析采用SPSS17.0、GraphPad Prism5、SIMCA-P11.5等软件，统计方法包括单因素方差分析、主成分分析和逐步多元回归，P<0.05为差异有显著性。　　结果与讨论：　　1、微波辅助衍生化法及方法学验证：使用吡啶为溶媒，低火反应2 min，可以提高效率，节省时间，适用于大批次生物样本的代谢组学研究。标准品各氨基酸响应值与其浓度间呈良好的线性关系(R2﹥0.99，除Ser0.9591)，日内/日间精密度RSD均小于15%；脾脏至少检出12种游离氨基酸，其中各氨基酸日内精密度 RSD3.47%~19.72%，日间精密度RSD4.03%~19.07%；除Gly(25.69%)和Tyr(21.21%)外，余氨基酸重现性RSD均小于20%，硅烷化产物室温下6h稳定性良好(RSD﹤10%)。　　2、应用SIMCA-P软件对不同温度组脾组织氨基酸含量主成分分析，第一、二主成分：15℃组死后0 h~60 h聚集分布于得分图左边，与60 h~156 h样本分离，提示死后60 h氨基酸组成变化不明显，60 h后变化较显著；25℃组死后0 h~24 h主成分聚集，24 h后分离明显，提示24 h氨基酸组成变化不甚显著，之后变化显著；30℃组死后24 h内主成分明显分离且均位于得分图左边，24 h后则分布于右边，提示死后24 h内脾组织氨基酸组成变化显著，24 h后氨基酸组成变化较小，证实环境温度对于脾组织蛋白质等生物大分子降解影响显著。　　3、各温度组24 h和60 h时间点的氨基酸含量比0 h的增长倍数：15℃组的分别为-0.6~3.7倍、-0.2~12.9倍；25℃组的分别为0.4~6.6倍、-0.2~53.6；30℃组的分别为-0.9~8.5倍、-0.9~16.6倍。说明随着环境温度升高，脾组织蛋白质降解速率增快。但是，作为自溶腐败引起生物大分子蛋白质降解为氨基酸产物过程中，环境温度与化学反应之间的关系，与无机化学的范特霍夫规则存在不同，有待进一步研究。　　4、多元逐步回归法，筛选氨基酸标志物，建立基于不同温度下尸体脾组织氨基酸含量变化推断PMI的数学模型：　　15℃组：y=-3.868+69.686xAla+63.287xVal(窗口期0 h~156 h)，R2=0.881，P﹤0.01，S.E.=15.68 h；　　25℃组：y=10.947+12.284xAla+20.487xVal+9.681xLys-25.844xGln-7.028xILeu(窗口期0 h~132 h)，R2=0.852，P﹤0.01，S.E.=15.83 h；　　30℃组：y=74.291-55.947xGly-40.578xGlu+26.290xTyr-63.878xAsp(窗口期0 h~108 h)，R2=0.605，P﹤0.05，S.E.=20.77 h。　　(注：方程中y表示PMI，x表示各氨基酸矫正峰面积)　　上述模型经检验，标准化残差P-P图累积概率成线性，残差符合正态分布。共线性诊断结果提示模型有意义，方程稳定。　　5、25℃组形态学：随PMI延长，脾组织逐渐失去光泽，纹理消失，瘫软、海绵样空泡状，腐败气泡，腐败液增多。HE染色，组织结构从清晰、排列规则紧密，逐渐肿胀模糊、结构紊乱消失，轮廓残留。弹力纤维染色，动脉内弹性膜结构致密清晰、规则束状环层波浪状排列，逐渐局部增粗、凝聚，部分分离、断裂、崩解等。　　6、脾组织大体染色的RGB、R、G、B检测均呈时序性下降趋势(P﹤0.01)，死后0 h~120 h与PMI具有一定的相关性。HE染色组织量化观测，间隙总面积推断PMI窗口期0h~108 h(R2=0.825)，核总面积及IOD的窗口期0 h~48 h，分别R2=0.911、R2=0.609。　　7、25℃组，将所有指标进行多元逐步回归，最终得到拟合方程：y=99.404-0.699 xR+5.375xAla+91.195xMet-16.88xAsp+9.073xGlu-13.908xLeu(窗口期0 h~132 h)，R2=0.989，P﹤0.01，S.E.=5.22 h　　结论：　　1、本研究改良传统的衍生化方法，建立微波辅助衍生化，显著缩短反应时间，更适用批量生物组织检材的代谢组学研究；　　2、GC-MS检测尸体脾组织时序性代谢降解轮廓，证实了随PMI延长，游离氨基酸等小分子物质含量时序性增多的变化规律，符合自溶腐败过程中生物大分子单向降解反应，产生基本结构的氨基酸小分子的尸体生物化学原理，可筛选出与PMI相关性好的生物标志物，获得多元组合推断PMI回归方程；　　3、通过3个不同温度组对比研究，证实了温度明显影响尸体组织氨基酸降解代谢速率，不同氨基酸其代谢速率与环境温度之间的关系各不相同，呈不同于无机化学范特霍夫规则的复杂非线性，尚需进一步深入研究；　　4、尸体脾组织形态结构的量化病理学呈时序性变化，可用于辅助推断PMI。