原发性肝癌位居全球恶性肿瘤发病率第6位,死亡率第3位,占中国恶性肿瘤死亡率第2位。肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是原发性肝癌最主要的组织学类型,约占所有原发性肝癌病例的70%-85%。手术切除是目前肝癌患者获得治愈及长期生存的主要治疗手段,但肝癌5年转移复发率在接受根治性切除术后仍高于60%。因此,转移复发是目前影响肝癌患者总生存率的主要问题；解决此问题需两方面的工作,一是明确转移复发的分子机制,二是寻找合适的预测预后、指导个体化治疗的生物标志物(Biomarker)。尽管研究者在基因组和蛋白质组领域已做了很多工作,但至今并未得到非常满意的结果。蛋白的糖基化是重要的翻译后修饰,是蛋白质成熟并获得生物学功能的关键步骤。大多数分泌性蛋白和几乎所有的免疫相关蛋白都是糖蛋白；糖蛋白在恶性肿瘤的发生过程中参与细胞恶性转化的信号转导,提示病灶周围的微环境变化,与恶性肿瘤的侵袭转移亦紧密相关,因此很多已知的癌相关生物标志物也都是糖蛋白,如AFP、CEA、CA125和PSA等；由此可见,糖蛋白组学在肿瘤研究中具有重要而独特的地位。目前很多研究表明糖蛋白不仅可能成为肝癌诊断和转移复发相关的分子标记物,也有能力成为有效的治疗靶点。基于以上的理论背景,本研究在近年来糖蛋白富集、标记和分析技术最新进展的基础上,拟针对目前糖蛋白组学研究的部分不足,建立了一个整体性的研究策略；应用凝集素(Lectin)层析纯化得到不同糖链类型的蛋白样本,联合固化胰蛋白酶(Immobilized Trypsin)及肽N-糖苷酶F (PNGase F)进行序贯180标记,将不同糖型的配对蛋白样本以质谱进行相对定量,而且建立基于Mascot Distiller软件的自建算法,自动化处理定量数据,最终能够全面研究复杂生物样本中的不同糖链结构类型的糖蛋白改变。将所建立的研究策略进一步应用到接受根治性切除术的早期HCC患者(BCLC O-A期)中；对其术前血清中N-糖蛋白,按不同糖型富集分类,进行定量糖蛋白质组学研究,寻找与术后转移复发相关的特定糖链结构的N-糖蛋白,探讨这些糖蛋白作为HCC预后相关的分子标记物的可能性,为肝癌患者术后转移复发的预测和干预治疗提供特异的糖标志物和治疗靶点；并为今后研究这些糖蛋白糖基化在HCC发生、发展中的作用,提供一个有用的工具。第一部分凝集素富集糖肽联合酶促18O3标记的定量N-糖蛋白组学方法的建立和初步验证目的：糖蛋白组学在肿瘤研究中具有显著意义。最近一些串联18O3标记技术被引入糖蛋白相对定量研究中,但均局限于对总糖蛋白或总糖链的研究,未关注到特定糖蛋白的糖链类型改变在肿瘤发生发展中的重要作用,且这些新18O3标记技术缺乏成熟的定量软件支持,数据分析繁琐费时。本实验针对上述不足,建立一种凝集素层析联合酶促18O3稳定同位素标记技术,结合自建的定量算法支持,从而构成一个整合性的N-糖蛋白组学定量研究策略。方法：将标准糖蛋白转化酶(Invertase)和胎球蛋白(Fetuin)酶解后,以ConA Lectin层析,配对样本以Immobilized Trypsin和PNGase F分别进行18O/16O稳定同位素标记,标记后的配对样本按1：10-10：1的不同比例混合后,以LC-ESI-MS/MS检测。首先手工处理质谱数据,确定本方法的线性和准确性；并与自建算法所得数据对比,验证自建算法的可靠性。将此定量研究策略应用于3例HCC患者和3例健康对照组间,分别以ConA、WGA和LCH层析临床血清样本,得到带有3种特异糖型的亚组糖蛋白,将HCC患者和健康人的同一类型亚组进行定量糖蛋白组学研究,对部分差异蛋白进行Western blot验证,以在实际临床样本中进一步检验本策略的可靠性和可行性。结果：在标准糖蛋白中,本方法保持足够的准确性和可重复性,在1：10-10：1的范围内保持线性,糖肽和糖蛋白数据的线性相关系数(Correlation coefficient,r2)均>0.99。以基于Mascot Distiller软件的自建算法分析数据,所得结果与理论值及手工计算结果非常接近,同样保持足够的准确性和线性。SD值介于0.023-0.186之间(糖肽)及0.075-0.216之间(糖蛋白)。在对正常人和肝癌患者的ConA、 LCH和WGA3类亚组血清糖蛋白的分别对比和定量分析中,一共确定了有43种糖肽、35种糖蛋白发生了不同程度的改变,其中有14种糖肽和13种糖蛋白同时在3个亚组中发生不同程度的改变。手工验证和Western blot结果进一步证实了本方法对于实际临床样本定量分析的可靠性。结论：凝集素层析富集糖蛋白联合酶促18O3稳定同位素标记技术,结合自建算法的自动化分析,是一种整合性的N-糖蛋白标记和定量方法,具有较好的准确性和可重复性；能够将糖链类型改变和糖蛋白丰度改变结合起来,且可以应用于临床复杂样本的处理分析,是一种较好的糖蛋白组学研究策略。第二部分凝集素富集糖肽联合酶促18O3标记的定量N-糖蛋白组学方法在肝癌患者术后转移复发研究中的应用目的：本研究应用自建的凝集素层析富集糖肽联合酶促18O3标记的定量N-糖蛋白组学研究策略,以接受根治性切除术的HCC患者为研究对象,对其术前血清中N-糖蛋白进行研究,寻找HCC患者血清中与术后转移复发相关的具有特征性糖链类型的N-糖蛋白,探讨其作为转移复发相关“糖标志物”的可能性。方法：在40例早期HCC患者(BCLC O-A期)构成的癌与癌旁组织配对的样本群中,利用凝集素芯片(Lectin microarray)和糖蛋白胶上染色技术,分别比较复发和无复发组HCC患者的癌与癌旁组织,初步确定与HCC转移复发密切相关的特征性糖链改变及与之对应的凝集素种类。在另一早期HCC患者血清样本群中,按术后随访有无转移复发分别选取两组共40例(每组20例),根据上步实验选择凝集素ConA、LCH、WGA,利用第一部分研究所建立的整合性N-糖蛋白组学定量研究策略,分别以亲水层析及凝集素层析富集糖肽联合酶促1803标记,进行定量N-糖蛋白组学比较分析,筛选出血清中与转移复发相关的,特征性糖链类型的糖蛋白改变。在共计60例早期HCC患者血清的独立样本群中,对部分差异糖蛋白进行Western blot验证,统计学分析其对预后和转移复发的预测价值,单因素和多因素Cox回归分析其与HCC患者术后复发的关系及是否为独立预测因素,最后在肝癌细胞系中进一步验证上述发现。结果：在对早期HCC患者癌及癌旁组织进行的凝集素芯片与糖蛋白胶上染色研究中,发现多个Lectin所对应的糖链类型,在复发与无复发组间存在差异。以其中3种Lectin层析HCC患者血清糖蛋白进行标记及定量研究后,发现有44个糖蛋白在总糖蛋白组及ConA、LCH和WGA富集的特异性糖链类型的亚糖蛋白组中,发生丰度改变,其中16个糖蛋白同时在多个亚糖蛋白组/总糖蛋白组发生不同的丰度改变。选择MASP1、QSOX1、Ceru、LG3BP和Thrombin蛋白进行Western blot验证,结果提示血清中LCH富集的QSOX1糖蛋白(即带有α-1,6岩藻糖基化的QSOX1蛋白),其表达水平在未复发组显著高于复发组,以中位数为界值分析其与HCC术后转移复发及总生存的相关性,单因素及多因素分析均发现其表达与至复发时间(TTR)显著负相关(单因素：HR= 0.452,95%CI =0.211-0.972, p= 0.042;多因素：HR= 0.458,95%CI=0.213-0.988,p=0.047),与总生存(OS)无关。在肝癌细胞系中的初步验证表明,QSOX1表达随细胞系转移潜能的升高而降低,是保护性因子。结论：早期HCC患者术前血清中,存在与转移复发相关的具有特征性糖链类型的糖蛋白；血清中带有α-1,6岩藻糖基化的QSOX1蛋白,其表达水平与早期HCC患者术后转移复发密切负相关,是预测早期HCC患者根治术后复发的糖分子标签。QSOX1蛋白在肝癌细胞系中表达,且其表达随肝癌细胞系转移潜能的升高而降低,是潜在的抑癌分子。结论1.凝集素层析富集糖肽联合酶促18O3稳定同位素标记技术,结合自建算法的自动化分析,是一种整合性的N-糖蛋白标记和定量方法,具有较好的准确性和可重复性；能够将糖链类型改变和糖蛋白丰度改变结合起来,且可以应用于临床复杂样本的处理分析,是一种高通量的N-糖蛋白组定量比较的研究策略。2.基于Mascot Distiller软件的自建算法,能够为18O3稳定同位素标记的数据分析,提供快速、准确及可靠的结果,可以替代繁琐费时的手工计算,为临床样本的高通量分析提供支持。3.早期HCC患者术前血清中LCH富集的α-1,6岩藻糖基化的QSOX1蛋白,其表达水平与早期HCC患者的复发负相关,是预测早期HCC患者根治术后复发的糖分子标签。4. QSOX1蛋白在肝癌细胞系中表达,且其表达随肝癌细胞系转移潜能的升高而明显降低,是潜在的转移抑制分子。创新点1.建立了新的凝集素层析联合酶促18O3稳定同位素标记技术,并证实其具有良好的准确性和可重复性,能够用于临床复杂生物样本的研究。2.建立了新的基于Mascot Distiller软件的自建算法,可以替代手工计算,为1803稳定同位素标记提供准确可靠的结果。3.首次报道了α-1,6岩藻糖基化的QSOX1蛋白与早期HCC患者术后转移复发密切相关,可能成为临床预测HCC术后复发的分子标签。4.首次报道了QSOX1蛋白在肝癌细胞系中的表达随转移潜能的升高而明显降低,是潜在的转移抑制分子。潜在应用价值1.外周血中α-1,6岩藻糖基化QSOX1的表达水平可预测接受根治手术的早期HCC患者的预后。2.对α-1,6岩藻糖基化QSOX1在HCC患者转移复发病理过程中的作用机制研究,可能为预防和治疗HCC患者根治术后转移复发,提供新的干预策略。3.凝集素层析联合酶促1803稳定同位素标记技术可用于其它疾病相关的糖蛋白组学定量研究。本技术已申请国家专利,专利申请号：201210022570.1。