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目的:我们将探索经阿霉素处理的间充质干细胞分泌的外泌体（Doxorubicin treated mesenchymal stem cells exosomes,Dt-MSC-exo）对乳腺癌化疗耐药的影响及机制,寻找可能的耐药分子机制,从而获得可能的耐药靶点并为乳腺癌的精准治疗提供新的选择。方法:1.收集用阿霉素（Doxorubicin,Dox）及生理盐水分别处理的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的培养上清液,获得MSCs条件培养液与Dox处理的MSCs（Doxorubicin treated MSCs,Dox-treated-MSC）条件培养液,并与MDA-MB-231、MCF-7细胞共培养,通过CCK-8（CCK-8Assay）、LDH（Lactate dehydrogenase）、流式细胞术检测MSCs条件培养液与Dox-treated-MSC条件培养液对MDA-MB-231、MCF-7细胞耐受Dox的影响。2.间充质干细胞分泌的外泌体（Mesenchymal stem cells exosomes,MSC-exo）的分离提取及鉴定。采用超速离心法从MSCs条件培养液与Dox-treated-MSC条件培养液中提取外泌体,利用透射电镜分析进行鉴定外泌体的形态,蛋白免疫印迹（Western blot,WB）检测外泌体的表面蛋白标志物。3.MSC-exo和Dt-MSC-exo与MDA-MB-231、MCF-7细胞共培养后,采用CCK-8、LDH及流式细胞术实验方法检测MSC-exo和Dt-MSC-exo对MDA-MB-231、MCF-7细胞耐受Dox的影响。4.应用GEO数据库,分析筛选未处理的MCF-7细胞和受MSC-exo处理的MCF-7细胞之间的差异表达m RNA,制成热图。随后实验分3组:（1）control组,（2）MSC-exo组,（3）Dt-MSC-exo组,用实时荧光定量PCR（real-time quantitative-PCR,q PCR）和WB分别检测各组MDA-MB-231、MCF-7细胞中差异基因m RNA和蛋白表达情况。5.在MDA-MB-231、MCF-7细胞中下调差异表达基因S100A6后,与MSC-exo和Dt-MSC-exo共培养,采用q PCR和WB分别检测各组MDA-MB-231、MCF-7细胞内S100A6 m RNA和蛋白表达变化,接着用CCK-8、流式细胞术实验方法检测MSC-exo和Dt-MSC-exo对MDA-MB-231、MCF-7细胞耐受Dox的影响。随后,在MSCs中下调S100A6的表达,用q PCR和WB检测MSCs和Dox处理的MSCs中S100A6 m RNA和蛋白的表达变化,并收集MSCs的外泌体与MDA-MB-231、MCF-7细胞共培养后,用q PCR检测各组MDA-MB-231、MCF-7细胞中S100A6 m RNA的表达变化。6.结合文献报道及基因预选结果,确定候选的mi RNA（mi R-21-5p）,再通过q PCR检测MSCs和MSC-exo及受Dox处理后mi R-21-5p m RNA的表达。在MDA-MB-231、MCF-7细胞中转染mi R-21-5p agomir（下调mi R-21-5p）后,与MSC-exo和Dt-MSC-exo共培养,采用q PCR检测各组MDA-MB-231、MCF-7细胞中mi R-21-5p和S100A6 m RNA的表达,确认S100A6与mi R-21-5p之间的相关性。随后在MSC-exo和Dt-MSC-exo中下调mi R-21-5p的表达,与MDA-MB-231、MCF-7细胞共培养,用q PCR检测各组MDA-MB-231、MCF-7细胞中S100A6 m RNA的表达,并通过CCK8、流式细胞术检测MSC-exo和Dt-MSC-exo对MDA-MB-231、MCF-7细胞耐受Dox的影响。结果:1.MSCs条件培养液和Dox-treated-MSC条件培养液可以显著增强MDA-MB-231、MCF-7细胞对Dox的耐药性,且与MSCs条件培养液相比,Dox-treated-MSC条件培养液导致MDA-MB-231、MCF-7细胞对Dox的耐药性更大。2.通过超速离心法从MSCs条件培养液和Dox-treated-MSC条件培养液中分离外泌体。透射电子显微镜下观察到卵圆形或杯状双层膜包裹的囊泡小体,直径范围在40～100nm,WB结果显示外泌体的表面蛋白CD9,CD63,CD81,TSG101均阳性。3.MSC-exo和Dt-MSC-exo可以显著增强MDA-MB-231、MCF-7细胞对Dox的耐药性,且与MSC-exo相比,Dt-MSC-exo导致MDA-MB-231、MCF-7细胞对Dox的耐药性更大。4.GEO数据库（GSE46950）预测筛选出MSC-exo和Dt-MSC-exo可显著提高MDA-MB-231、MCF-7细胞中S100A6的表达,且与MSC-exo相比,Dt-MSC-exo导致MDA-MB-231、MCF-7细胞中S100A6的表达比MSC-exo更高。5.下调MDA-MB-231、MCF-7细胞中S100A6的表达,可以显著抑制Dt-MSC-exo对MDA-MB-231、MCF-7细胞耐受Dox的促进作用,且消除MSC-exo和Dt-MSC-exo之间MDA-MB-231、MCF-7细胞对Dox耐药性的显著性差异。然而,在MSCs中下调S100A6的表达,MSC-exo和Dt-MSC-exo对MDA-MB-231、MCF-7细胞中S100A6的提升无显著作用。6.MSC-exo和Dt-MSC-exo通过传递mi R-21-5p,促进MDA-MB-231、MCF-7细胞中S100A6的表达,S100A6与mi R-21-5p呈正相关性。下调MSC-exo中mi R-21-5p的表达,可以显著抑制Dt-MSC-exo对MDA-MB-231、MCF-7细胞耐受Dox的促进作用;更重要的是,消除了S100A6水平的升高效应及消除MSC-exo和Dt-MSC-exo之间MDA-MB-231、MCF-7细胞对Dox耐药性的显著性差异。结论:1.经Dox处理的MSC-exo可显著增强MDA-MB-231、MCF-7细胞对Dox的耐药性。2.经Dox处理的MSC-exo通过递送mi R-21-5p,促进MDA-MB-231、MCF-7细胞中S100A6的表达可能是增强MDA-MB-231、MCF-7细胞对Dox耐药性的机制之一。