檀香Santalum album L.为檀香科Santalaceae檀香属Santalum植物,其心材富含挥发油,广泛应用于香料、雕刻及医疗保健等方面。檀香为常绿阔叶树种,枝叶茂盛,再生速度快,但至今未见檀香叶化学成分及合理利用的研究报道。为探索檀香叶的药用价值,综合开发利用檀香资源,本项研究对其化学成分、质控方法及标准、主要成分的提取纯化工艺等进行研究,为檀香叶的开发利用提供良好的物质基础。一、檀香叶黄酮类化学成分的分离与鉴定檀香叶以70%乙醇加热回流提取,提取液用大孔吸附树脂、聚酰胺、SephadexLH-20分离纯化,共得到8个黄酮类化合物。经光谱学(MS、UV、1H-NMR、13C-NMR)鉴定,分别鉴定为新西兰牡荆苷Ⅱ(芹菜素-6,8-二碳葡萄糖苷)、异荭草苷、荭草苷、牡荆苷、异牡荆苷、白杨素-6-C-葡萄糖苷、白杨素-8-C-葡萄糖苷、异鼠李素。上述化合物均为首次从该植物中分离得到。二、檀香叶高效液相色谱指纹图谱研究(一)色谱条件的选择通过系统实验,最终选定的最佳色谱检测条件为：Agilent TC-C18液相色谱柱(5μm,250 mm×4.6 mm. Agilent, USA);流动相：甲醇(B)-0.5%冰醋酸溶液(C)；梯度洗脱程序为：0-18min 22%B,18-20 min 22%-30%B,20-35 min 30%-31.5%B,35-42 min 31.5%B,42-44 min 31.5%-40%B,44-56 min 40%B,56-65 min 40%-60%B后运行8 min;流速：1 ml/mi n,检测波长：338nm,柱温：30℃。(二)方法学考察分别对HPLC指纹图谱方法的重复性、稳定性、精密度等方法学进行了考察,结果显示共有峰相对保留时间与相对峰面积RSD<10%,符合中药材指纹图谱要求。(三)檀香叶指纹图谱的分析与评价参考国家食品药品监督管理局制定的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》,按照本研究方法检测10批檀香叶药材的HPLC指纹图谱。本指纹谱共确定13个共有特征峰,其中通过与对照品溶液比较证明6号峰为新西兰牡荆苷Ⅱ,8号峰为荭草苷,10号峰为异荭草苷,11号峰为牡荆苷,12号峰为异牡荆苷。以12号峰异牡荆苷为参照峰分别计算各共有峰相对峰面积(Ra)、相对保留时间(Rt)、非共有峰相对面积等指纹图谱技术参数。通过10批样品检测结果显示,共有指纹峰全部出现且相对保留时间RSD(%)均小于1%,非共有峰占总峰面积均小于10%；共有指纹相对峰面积RSD(%)差异较大,部分成分超过50%。檀香叶HPLC指纹图谱的首次研究,为有效控制檀香叶的质量提供了新的手段。三、檀香叶质量研究(一)性状采集不同来源、不同采收期檀香叶进行形态学观察,并测定相关性状数据。本品叶片为椭圆状卵形,深绿色,膜质或薄革质,光滑,长4～8 cm,宽2～4 cm,顶端短尖或锐尖,基部楔形,全缘,网状脉,中脉在背面凸起；叶柄细长,长1～1.5 cm。气微,味微苦。(二)鉴别1.显微鉴别包括观察檀香叶的组织特征、表面特征、粉末特征鉴别。(1)本品横切面：表皮细胞方形,外壁增厚,被较薄角质层；维管束外韧型,形成层明显,外侧为数列厚角组织；叶肉组织无栅栏组织与海绵组织的分化,均为圆形或椭圆形薄壁细胞组成,细胞排列紧密；紧邻主脉及各级侧脉的薄壁细胞内有大量簇晶,围绕维管束呈环状排列,随侧脉延伸数量逐渐减少。(2)本品表面观：叶上表皮细胞方形或多角形紧密排列,无气孔分布,无毛茸。下表皮细胞多角形,分布有大量气孔,平轴式；单位面积(mm2)气孔数：622.2个,气孔指数：0.28,脉岛数：27.8～33.3个。围绕主脉及各级侧脉分布有大量簇晶,随着侧脉逐渐减弱,簇晶数量也逐渐减少。(3)本品粉末特征：本品粉末深绿色；簇晶较多,棱角尖锐,直径10～15μm,多分布于紧邻叶脉维管束的薄壁细胞中,也有部分散落；表皮细胞多角形,排列紧密,气孔平轴式：导管多为螺纹导管或网纹导管。2.薄层色谱鉴别取本品粉末0.5 g,加入乙醇20 ml超声提取15 min,滤过,滤液作为供试品溶液。另取牡荆苷、异牡荆苷对照品加甲醇制成0.1 mg/ml溶液,作为对照品溶液。照《中国药典》2010年版一部,附录Ⅵ-B“薄层色谱法”测定,吸取供试品溶液5μl,对照品溶液2μl,分别点于同一块聚酰胺薄膜,以甲醇-乙酸乙酯-水(3：1：2)为展开剂展开,取出,晾干喷以5%三氯化铝乙醇溶液,105℃加热至在紫外灯(365 nm)下斑点清晰。供试品中在与对照品相同位置上显相同颜色的荧光斑点。(三)检查按照灰分测定法《中华人民共和国药典》2010年版(一部)附录ⅨK“灰分测定法”测定。供试品中总灰分约为7.0%。(四)含量测定照《中国药典》2010版一部,附录Ⅵ-D“高效液相色谱法”测定。1.色谱条件：色谱柱：Agilent Cl 8 (4.6 mm×150 mm,5μm)流动相：甲醇：水：冰醋酸=40：60：0.5；检测波长338 nm；柱温：30℃；流速：1 ml/min;进样量：5μl。2.样品制备檀香叶于60℃烘箱中烘干,粉碎,过40目筛。取粉1 g精密称定,置于50 ml容量瓶中,70%乙醇定容至刻度,50℃超声40 min,放至室温后70%乙醇定容,0.45μm滤膜滤过,作为供试品。3.方法学考察方法学研究结果显示牡荆苷与异牡荆苷的线性及范围分别为：y=3.9253x+31.797, R2=0.995,线性范围为7.625～488μg/ml；异牡荆苷y=4.8079x+29.32,R2=0.999,线性范围为8.047～515μg/ml；精密度RSD分别为0.62%与0.63%,精密度良好；稳定性实验通过在2、4、8、12、24测定样品含量,牡荆苷与异牡荆苷的峰面积RSD分别为3.1%与2.8%,两种黄酮在样品中24小时内稳定；重复性实验显示5次重复测定,牡荆苷与异牡荆苷RDS均小于5%,说明方法重复性良好；加样回收率实验牡荆苷与异牡荆苷在高、中、低浓度的回收率分别为95.55%/95.86%,96.59%/96.95%,96.76%/97.13%,RSD为0.28/0.42,方法的准确度良好。4.样品测定对采自湛江南药场的3批样品进行含量测定,结果显示牡荆苷含量在1.13～1.25mg/g,异牡荆苷含量在1.2～1.46 mg/g。本章系统的对檀香叶进行了质量研究,所建立的方法和指标可作为檀香叶质量控制的依据。四、檀香叶中七种黄酮苷的动态变化规律研究(一)建立HPLC同时测定7种黄酮碳苷含量的方法1.方法学考察分别对7种黄酮的精密度、线性范围、准确度、重复性、稳定性进行考察。7种黄酮的线性、范围(mg)分别为：y=919.05x～25.556,R2=0.9993,0.02098～2.1698 mg(新西兰牡荆苷Ⅱ)；y=1205x～22.362,R2=0.9994,0.01987～1.9874 mg(荭草苷)；y=1334.4x～31.797,R2=0.995,0.02058～2.0580 mg(异荭草苷)；y=1728.2x～17.211,R2=0.995,0.02041～2.0408 mg(牡荆甘)；y=2231.9x～40.665,R2=0.995,0.02152～2.1521mg(异牡荆苷)；y=1108.3x～6.1395,R2=0.996,0.01084～1.0849 mg(白杨素-8-C-葡萄糖苷)；y=2883.4x～25.446,R2=0.9970,009842～0.9842 mg(白杨素-6-C-葡萄糖苷)；精密度实验显示各化合物色谱峰RSD均小于4%,精密度良好；重复性实验结果显示各化合物色谱峰RSD均小于5%,方法的重复性良好；稳定性实验证实各化合物在24小时内稳定(RSD<5%)；加样回收率实验结果显示7种物质的回收率在95%～97%之间。2.含量测定通过含量测定,檀香叶中待测成分含量从高到底的顺序依次为：异牡荆苷>牡荆苷>异荭草苷>荭草苷>白杨素-8-C-葡萄糖苷>白杨素-6-C-葡萄糖苷。通过面积归一化法(338 nm),异牡荆苷与牡荆苷分别占总峰面积的35～45%与20～30%,总含量为2%～6%之间,是已有文献报道的含量最高的植物物种。(二)不同采收期檀香叶样品含量测定通过对12个月檀香叶黄酮成分总量的分析可以得出以下结论：黄酮苷的总量约占檀香叶干重的3～7%之间,2～3月为最低点,约为3.3%左右,随后含量逐月升高,8～10月为最高时间段,约为6.2%左右,随后略降低,12月至次年1月含量基本相同约为5%左右。8～10月檀香叶黄酮含量达到了一个最高平台期,约为含量最低时(2～3月)的2倍左右,此时也是叶的快速生长期,因此檀香叶产量与黄酮含量最大值相统一,8～10月为檀香叶的最佳采收时期。考察范围内的5棵檀香树黄酮含量相差较悬殊,相同月份含量可能差距近一倍。造成差异的原因是否仅为个体差异还待进一步研究。互为同分异构体的成分含量变化趋势相似且基本保持恒定的比例变化。新西兰牡荆苷Ⅱ的变化规律基本同牡荆苷-异牡荆苷;荭草苷-异荭草苷成分组在10月以后与上述成分变化趋势表现出差异,其含量未降低而是保持继续升高,连同次年1月成为全年的高点。由此推测这几个相似结构成分的关键调控酶具有同源性,且酶的表达量或活性处于一定比例的平衡状态。白杨素-8-C-葡萄糖苷与白杨素-6-C-葡萄糖苷的变化规律与以上几种成分存在较大差异,如2～3月其含量为全年的高点,此时其他几种成分为全年的低点；8～9月为全年的低点,而其他成分处于全年的较高水平。(三)不同叶龄檀香叶总黄酮含量变化老叶与嫩叶总黄酮含量在4～11月间差异明显,尤其在5～10月嫩叶中总黄酮含量超过老叶的两倍有余；12月至次年3月间二者差异较小。以上规律同檀香叶的生长周期相同,由此推测檀香叶中总黄酮类成分在生长早期快速形成,此后形成速度低于初生代谢产物的累积速度。(四)不同树龄总黄酮含量变化通过比较同期3年生、6年生、10年以上生三个树龄段檀香叶黄酮总量的变化可看出,3-6年生阶段檀香树叶总黄酮含量差异较小,10年以上生檀香树叶总黄酮含量显著增高,约为前两个树龄段的2倍。10年以上生檀香结香组的总黄酮含量略高于未结香组。(五)药物刺激对檀香叶总黄酮的影响激素(乙烯利)刺激组在刺激前及刺激后1月内待测总黄酮无明显变化,总黄酮含量低于正常空白对照组(未受刺激)；在刺激后第8周总黄酮含量显著增高,可提升至原来的2～4倍,且3%激素组>2%激素组>溶剂空白对照组。据此推测其原因可能为植物在外源性物质的作用下产生应激反应,使黄酮相关合成酶的合成加快或活性增强,从而带来总黄酮含量的迅速提高；或者为外源性物质影响植物的正常生理代谢,使叶片生长受到抑制,而对黄酮相关合成酶没有显著影响,在这种作用下黄酮不断累积增多而叶重增长缓慢或停滞综合农现出黄酮类成分含量的升高。(六)干燥与腐烂对总黄酮含量的影响比较同期干燥与新鲜样品及叶腐烂前后黄酮类成分种类及含量变化。结果显示叶干燥前后黄酮的成分及含量无明显变化；腐烂叶黄酮成分无变化,但总含量减少约50%。故檀香叶可于60℃烘干,并注意防腐。五、檀香叶中牡荆苷与异牡荆苷提取分离工艺研究根据黄酮类化合物提取的研究基础和现状,结合具体实验条件,以牡荆苷与异牡荆苷的含量作为主要工艺指标,通过单因素试验考察了檀香叶的最佳提取方法及粗分离方法。(一)提取工艺研究通过考察提取方法、乙醇浓度、提取温度、提取次数等因素确定了以牡荆苷和异牡荆苷为指标的最佳提取工艺为：70%乙醇50℃恒温超声提取2次,每次40 min。(二)大孔吸附树脂分离纯化牡荆苷与异牡荆苷的工艺研究通过不同吸附树脂对牡荆苷与异牡荆苷的动态吸附率试验、洗脱溶剂考察、洗脱液纯度考察等确定大孔吸附树脂法纯化檀香叶中牡荆苷与异牡荆苷的工艺为：AB-8大孔吸附树脂,上样液浓度为0.5g生药/ml,上样量为：≤6.6%(生药／树脂)或≤1.49%(异牡荆苷与牡荆苷总量/树脂),洗脱顺序为：10%乙醇洗脱除去糖类及多酚类水溶性物质,洗脱体积约10～12 BV(至流出液无色),换用30%乙醇,4～5 BV(洗脱率>85%)。洗脱物中牡荆苷与异牡荆苷含量约为5.85%和20.41%六、异牡荆苷药代动力学与组织分布初步研究建立了以芦丁为内标的异牡荆苷在大鼠血浆及不同组织中的高效液相色谱检测方法,并应用该方法进行了异牡荆苷在大鼠体内的药代动力学及组织分布研究。色谱条件为：RP-C18色谱柱(250 mm×4.6mm,5.0μm),以甲醇-1%冰醋酸溶液(40：60,v/v)为流动相,柱温为30℃,检测波长为338 nm。通过专属性、精密度、线性、准确度、稳定性、提取回收率、最低定量限等方法学考察,证实本方法可对血浆及不同组织中的异牡荆苷进行准确检测。大鼠在静脉注射异牡荆苷后,在预定的时间点取样检测,药-时数据通过DAS软件智能模式拟合,异牡荆苷的药代动力学特征较符合二室模型。给药剂量同AUCo-t具有良好的线性相关性(p<0.01),异牡荆苷在所研究剂量范围内的代谢为线性动力学过程。t1/2β在35～40 min,代谢速度较快。组织分布研究显示药物在不同组织中浓度从高到低分别为肾>肝>肺≈卵巢>心≈脾>脑。