目的:探讨血管紧张素Ⅱ1型受体相关蛋白(Angtiotensin Ⅱ type 1 receptor associated protein,ATRAP)对体外培养的血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscular cell,VSMC)凋亡的影响及相关机制;腺病毒过表达的ATRAP对颈动脉球囊损伤引起的内膜增生的作用。从而丰富ATRAP抑制颈动脉内膜增生的作用机制,并为临床治疗颈动脉术后再狭窄提供新的治疗方向。方法:体外实验:1 VSMC的获得、培养与鉴定VSMC购自广州吉妮欧生物科技有限公司。取自大鼠胸主动脉段组织,酶消化法获得。在添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM的培养基中常规培养,在leica倒置显微镜下观察细胞生长状态、汇合度等;用α-SM-actin鉴定VSMC细胞表型。2 TUNEL检测腺病毒过表达的ATRAP对VSMC凋亡的影响2.1构建ATRAP过表达腺病毒与对照病毒由汉恒生物科技(上海)有限公司构建ATRAP的腺病毒过表达载体并提供对照腺病毒。2.2 TUNEL测定ATRAP过表达对VSMC凋亡的影响VSMC培养至5-7代,汇合度达90%,胰酶消化后,接种至96孔板(1x105 cells/ml),汇合度达50-70%时,转染Adv.ATRAP或Adv.GFP,24小时后更换为在添加0.1%FBS的高糖DMEM培养基中培养24小时以获得同步化,添加或不添加AngⅡ(100nM)继续培养24h,用原位末端转移酶标记技术(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay;TUNEL assay)测定VSMC凋亡的改变,在leica活细胞工作站测定细胞凋亡的比例。2.3 总RNA提取及荧光定量PCR测定凋亡相关基因mRNA表达的改变VSMC接种于6孔板,余处理同前述。用RNAisoplus试剂盒提取VSMC的总RNA,按照PrimeScriptTMRT Master Mix反转录试剂盒说明书反转录cDNA,并在Applied Biosystems QuantStudio(?)6 Flex上进行荧光定量PCR测定凋亡相关基因的mRNA表达改变。2.4 Western blot检测ATRAP及凋亡相关蛋白的表达RIPA和PI(20:1)提取VSMC总蛋白,并用western blot检测ATRAP及凋亡相关蛋白(caspase 3,caspase 8,caspase 9,bcl-2,bax等)的表达改变。3 ATRAP干扰对VSMC凋亡的影响3.1 ATRAP siRNA及阴性对照的构建由上海吉玛制药技术有限公司合成ATRAP siRNA并提供阴性对照。3.2 ATRAP siRNA干扰序列干扰效率的鉴定VSMC 接种于 6 孔板,汇合度达 70-90%时,用 LipofectamineTM RNAiMAX Transfection Reagent(InvitrogennTM)转染 ATRAP siRNA 及阴性对照至培养基,48小时后用Trizol法提取总RNA,应用荧光定量PCR方法检测各组干扰序列对ATRAP的干扰效率。3.3 western blot检测ATRAP干扰对凋亡相关基因蛋白表达的改变细胞处理同上,提取细胞总蛋白,利用western blot技术测定ATRAP、GFP、cleaved-cas8、cleaved-cas-3、bcl-2、bax 等的改变,以 GAPDH 作为内参。4 westen blot检测过表达的ATRAP对VSMC凋亡影响的机制研究4.1 ATRAP对AngⅡ刺激引起的Akt磷酸化的作用VSMC接种至6孔板,汇合度达50-70%时,转染Adv.ATRAP或Adv.GFP,24小时后更换为含0.1%FBS的高糖DMEM培养基中培养24小时,添加AngⅡ(100nM)并在 0 min、30 min、45 min、60 min、2 h、4 h 提取磷酸化蛋白,并用 western blot方法检测p-Akt的改变。4.2 PTEN抑制剂影响ATRAP对AngⅡ刺激引起的Akt磷酸化的抑制按前述方法进行腺病毒转染后,在AngⅡ处理前4 h加入PTEN抑制剂bpv(200 nM),然后加入或不加 Ang Ⅱ(100nM)并在 0 min、30 min、45 min、60 min、2 h、4 h提取磷酸化蛋白,并用western blot方法检测p-Akt的改变。4.3 PTEN抑制剂对ATRAP过表达引起的VSMC凋亡的作用TUNEL测定PTEN抑制剂对ATRAP过表达引起的VSMC凋亡的影响,并分别用荧光定量PCR和western blot方法检测凋亡相关基因的mRNA及蛋白水平改变。体内实验5观察腺病毒转染的ATRAP对大鼠颈动脉球囊损伤引起的内膜增生的作用5.1大鼠颈动脉球囊损伤模型的构建及腺病毒的局部转染2F fogarty取栓导管损伤大鼠左侧颈总动脉,以2*10^9pfu的ATRAP过表达腺病毒或对照病毒局部孵育左颈总动脉30min。5.2腺病毒转染的ATRAP对大鼠颈动脉球囊损伤引起的内膜增生的影响在不同时间点(3天,7天,14天)处死大鼠并取左侧颈总动脉,分为两部分,一部分标本提取RNA检测ATRAP及凋亡相关基因的mRNA改变,另一部分标本用4%多聚甲醛固定后进行颈总动脉横截面血管弹力染色(Verhoeff-Van Gieson(VVG)染色)。6腺病毒转染的ATRAP对大鼠颈动脉球囊损伤处VSMC凋亡的影响Tunel/DAPI免疫荧光染色测定大鼠颈动脉球囊损伤处细胞凋亡的改变。结果:1 VSMC的获得、培养与鉴定倒置荧光纤维镜下可见细胞贴壁生长,单个细胞呈细长梭形,细胞生长致密处细胞平行排列成束,典型的“峰谷状”生长。用α-SM-actin染色后,通过倒置荧光显微镜观察,血管平滑肌细胞呈绿色荧光。2腺病毒过表达的ATRAP促进离体的大鼠VSMC凋亡2.1细胞处理腺病毒转染ATRAP至培养的VSMC24小时,更换0.1%FBS的DMEM培养基并加入Ang Ⅱ继续培养24小时后进行TUNEL染色发现,过表达的ATARP促进离体的VSMC凋亡,且与Ang Ⅱ刺激没有明显的相关性。Ang Ⅱ组:Adv.ATRAP组相比Adv.GFP 组,VSMC 凋亡率增高(11.50±1.66%比 1.13±0.27%,P<0.05);无 AngⅡ 组:Adv.ATRAP 组相比 Adv.GFP 组,VSMC 凋亡率增高(13.17±0.48%比 1.20±0.17%,P<0.05)。2.2荧光定量PCR结果检测ATRAP及凋亡相关基因mRNA的表达结果显示,ATRAP过表达引起促凋亡基因bax表达明显上调,抑制凋亡基因bcl-2表达下调。2.3 Western blot检测ATRAP及凋亡相关蛋白的表达western blot结果显示,ATRAP与GFP未形成融合蛋白,cleaved-caspase 8,cleaved-caspase 3,bax蛋白表达增加,bcl-2蛋白表达减低,而cleaved-caspase-9表达没有明显改变,表明ATRAP过表达可诱导VSMC促凋亡蛋白表达增加,且主要是通过死亡受体途径(外源性途径)促进VSMC凋亡。3 ATRAP干扰对VSMC凋亡的影响3.1 荧光定量PCR鉴定ATRAP干扰序列的干扰效果结果显示,325干扰序列组对ATRAP干扰效率高于其他两组,因此选用325干扰序列进行后续实验。3.2 westen blot检测凋亡相关蛋白的改变western blot 结果显示,ATRAP 干扰后,cleaved-caspase 8,cleaved-caspase 3,bax蛋白表达减低,bcl-2蛋白表达增高,表明ATRAP沉默后可抑制VSMC凋亡。4过表达的ATRAP促进VSMC凋亡的机制研究4.1 ATRAP抑制Ang Ⅱ刺激引起的Akt磷酸化在多个时间点(30 min、45 min、60 min、2 h、4 h),Adv.ATRAP 组相比Adv.GFP组,p-Akt蛋白表达明显减低(P<0.05),说明在VSMC中,ATRAP过表达抑制Ang Ⅱ刺激引起的Akt磷酸化。4.2 PTEN抑制剂可逆转ATRAP对Ang Ⅱ刺激引起的Akt磷酸化的抑制作用在多个时间点(30 min、45 min、60 min、2 h、4 h),Adv.ATRAP+bpv 组相比Adv.ATRAP组,p-Akt蛋白表达明显增高(P<0.05),说明在VSMC中,PTEN抑制剂可逆转ATRAP过表达对Ang Ⅱ刺激引起的Akt磷酸化的抑制。4.3 PTEN抑制剂可逆转ATRAP对VSMC凋亡的促进作用TUNEL结果显示,Adv.ATRAP+bpv组相比Adv.ATRAP组,VSMC凋亡明显减少,而与 Ang Ⅱ 存在无明显相关(Adv.ATRAP+Ang Ⅱ 组相比 Adv.ATRAP+Ang Ⅱ +bpv 组,11.50±1.66%比 1.81±0.19%,P<0.05;Adv.ATRAP 相比 Adv.ATRAP+bpv 组,13.17±0.48%比 1.45±0.15%,P<0.05);mRNA 及蛋白表达也支持 PTEN 抑制剂逆转ATRAP对VSMC凋亡的促进作用。体内实验5腺病毒转染的ATRAP抑制大鼠颈动脉球囊损伤引起的内膜增生在球囊损伤并腺病毒孵育后3天,Adv.ATRAP转染组相比Adv.GFP转染组,大鼠左颈总动脉内膜增生没有明显差异;而在球囊损伤并腺病毒孵育后7天、14天后,Adv.ATRAP组相比Adv.GFP转染组,内膜面积及内膜中膜比(I/M)明显减少(P<0.05)。6腺病毒转染的ATRAP促进大鼠颈动脉球囊损伤处VSMC的凋亡TUNEL/DAPI免疫荧光染色结果表明,在球囊损伤并腺病毒孵育后3天,Adv.ATRAP转染组相比Adv.GFP转染组,大鼠左颈总动脉内膜处细胞凋亡没有明显差异;而在球囊损伤并腺病毒孵育后7天、14天后,Adv.ATRAP组相比Adv.GFP转染组,内膜处细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。结论:1腺病毒过表达ATRAP促进离体大鼠VSMC的凋亡2腺病毒过表达的ATRAP抑制Ang Ⅱ刺激引起的Akt磷酸化3 PTEN抑制剂显著抑制了 ATRAP过表达诱导的离体大鼠VSMC的凋亡4 PTEN抑制剂可逆转ATRAP过表达对AngⅡ刺激引起的Akt磷酸化的抑制5 siRNA干扰ATRAP抑制VSMC凋亡6过表达ATRAP显著抑制大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成7过表达ATRAP促进大鼠颈动脉球囊损伤处的细胞凋亡