目的研究不同年龄大鼠:(1)年龄相关性大鼠皮肤结构的变化;(2)年龄相关性大鼠创面愈合能力的变化及其机制的研究,以阐明老年创面愈合延迟的机理,并为针对性的治疗提供理论依据与方案;(3)构建水凝胶材料包被EGF。通过EGF的缓释进行EGF对创面愈合的影响的年龄相关性机制进行探索研究;(4)建立简单稳定的不同年龄大鼠不同深度的烫伤模型,用于对烫伤愈合机制的年龄相关性研究。方法1.年龄相关性的大鼠皮肤结构的变化的研究取幼年(1月龄)、青年(2月龄)、中年(12月龄)、老年(22月龄)大鼠,在大鼠的胸背部和腰背部各取一个直径为8mm的皮肤活检组织。活检皮肤组织固定于4%多聚甲醛或液氮速冻保存在-80℃。(1)不同年龄大鼠背部正常皮肤活检,组织病理学分析(HE)(2)免疫荧光(IF)染色CD271~+细胞及EGFR膜蛋白表达(3)免疫蛋白印迹(WB)染色:EGFR/JAK2/STAT3/SOCs32.年龄相关性大鼠创面愈合能力的减退与机制研究取幼年(1月龄)、青年(2月龄)、中年(12月龄)、老年(22月龄)大鼠,在每只大鼠胸背部制备2个1cm纵行全层皮肤切线伤模型。在d0、d3、d7、d10、d13拍照,观察创面愈合情况,并在d0、d7、d13天取材,活检组织4%多聚甲醛固定或液氮速冻保存在-80℃。固定样本用于病理切片IF染色分析CD271和EGFR表达。提取冻存组织蛋白用于WB检测JAK2/STAT3/SOCs3信号通路的表达变化情况。(1)1cm纵行全层皮肤切线伤模型制备;(2)组织病理学分析(HE);(3)IF检测CD271和EGFR;(4)WB检测:JAK2/STAT3/SOCs3;3.控释EGF水凝胶的构建及其对创面愈合的影响与机制的研究采用羧甲基纤维素钠(CMC)与明胶(GL)聚合形成水凝胶包被RhEGF,我们构建了一种具有锁水保湿同时能够缓慢释放EGF的多糖水凝胶。选取幼年(1月龄)、青年(2月龄)、中年(12月龄)、老年(22月龄)大鼠,在每只大鼠中背部制备4个8mm直径的全层皮肤缺损,分别予以NS、EGF、CMC-GL、CMC-GL-GEF对创面进行处理。在d0、d3、d7、d10、d13拍照,观察创面愈合情况,并在d0、d7、d13天取材,活检组织4%多聚甲醛固定或液氮速冻保存在-80℃。固定样本用于组织病理学分析。提取冻存组织蛋白用于WB检测内源性EGF、bFGE、TGF-β1、vEGF表达变化情况。(1)构建缓释EGF水凝胶(CMC-GL-EGF)(2)水凝胶电镜(SEM)、流变测试和EGF释放测试(3)水凝胶生物安全性测试(4)创伤模型制备及处理;(5)组织病理学分析(HE、Masson);(6)IHC:胶原蛋白Ⅱ、Ⅲ,抗Ⅷ因子血管染色;(7)WB检测:EGF、bFGE、TGF-β1、vEGF;4.不同年龄大鼠不同深度的烫伤模型的建立取幼年(1月龄)、青年(2月龄)、中年(12月龄)、老年(22月龄)大鼠,在其中背部进行烫伤。采取的烫伤设备是自制的导热性能良好的不锈钢金属柱作为烫伤模块,在沸水中加热,与大鼠皮肤接触不同的时间,制备出深度不同的烫伤。(1)设置致伤时间梯度,将自制的烫伤模块沸水加热后,在不同年龄大鼠背部制备致伤时间不同的烫伤创面。肉眼下连续观察创面情况,伤后72小时取材病理检验确定烫伤深度。(2)另取9只2月龄大鼠随机分为三组(创面直径1 cm组、创面直径1.5cm组、创面直径2 cm组)。采用直径分别为1、1.5、2 cm,高度2 cm的金属柱,在大鼠背部制备4个(根据模型(2)所确定的致伤时间条件)深Ⅱ度烫伤模型,伤后0、6、24、48和72小时肉眼观察创面一般状况并进行比较。结果1.年龄相关性的大鼠皮肤结构的变化的研究(1)正常大鼠背部皮肤的组织结构排列有序。全层皮肤厚度在中年(12月龄)以前随年龄增长逐渐增厚,中年以后又逐渐降低,表皮层厚度出现年龄相关性变薄的变化趋势。(2)大鼠皮肤表皮、毛囊、皮脂腺的CD271~+细胞数量未见面临相关性改变,One-Way ANOVA,p>0.05,EGFR膜蛋白表达随年龄相关性降低,One-Way ANOVA,p<0.05;(3)WB检测显示CD271表达未见明显差异;EGFR表达呈年龄相关性降低;SOCs3表达呈年龄相关性逐渐增加,相应的JAK2表达逐渐降低,STAT3在幼年组表达明显高于其他组。2.年龄相关性大鼠创面愈合能力的减退与机制研究(1)老龄大鼠创面愈合能力明显降低,幼年组在创伤后d5愈合,青年组和中年组在d7愈合,但中年组愈合较差,创伤仍可见清晰的痕迹,老年组在d9愈合;(2)组织病理学分析显示,d3创面新生上皮厚度呈年龄相关性降低,存在显著性差异,One-Way ANOVA,p<0.05。d7创面上皮厚度逐渐降低趋于正常表皮厚度愈合能力明显降低,幼年组表皮厚度仍大于其他各组(3)IF检测老年大鼠创伤后皮肤CD271~+细胞分布未见明显差异性One-Way ANOVA,p>0.05。EGFR表达量在创伤后3天明显被激活:表达EGFR的细胞增殖,新生上皮增厚,新生上皮厚度呈年龄相关性降低,在正常组织中呈年龄相关性降低的EGFR,在创伤后表达荧光强度增强(intDen/Area)与幼年大鼠正常皮肤EGFR接近,One-Way ANOVA,p<0.05。(4)WB检测显示:创伤后d3创面SOCs3表达增强,呈年龄相关性。STAT3表达未见显著性差异。3.控释EGF水凝胶的构建及其对创面愈合的影响与机制的研究(1)随着GL浓度的增加,水凝胶越来越难以在表面铺展。在CMC浓度为50mg/ml,GL浓度为25 mg/mL的情况下,在角速度1-100 rap/min变化范围内,G’均大于G”,且曲线一直呈现平稳向上趋势,CMC-GL在体系内交联稳定呈凝胶态,且在创面具有柔和的涂抹性能。(2)EGF水凝胶因为具有三维网状结构,优异的生物相容性,可包裹蛋白或细胞从而保证其生理活性。通过SEM观察,CMC-GL-EGF水凝胶具有大量的不规则孔洞,三维网状结构。流变测试可以看出在角速度变化范围内,G’均大于G’’,且均率大于凝胶CMC-GL-2的流变变化曲线。证明EGF的加入不会破坏凝胶内部的交联结构,并且可能因为带负电的的EGF分散在CMC-GL-2相互连接的通道内与带负电的明胶相互有微弱的静电作用和氢键作用增加了整个体系的交联密度,使CMC-GL-EGF体系具有优于单纯CMC-GL-2凝胶的流变学性能。EGF包裹于凝胶内部可有效地保证其蛋白活性,同时可缓慢有序释放。在体外模拟体液的环境下(PBS),水凝胶中EGF可缓慢释放,且根据最大EGF包覆量多测的吸光度值(OD 280=?)可算出水凝胶在8 h是EGF的释放量为?。(3)CMC-GL和CMC-GL-EGF水凝胶处具有良好的生物安全性。不同浓度CMC-GL和CMC-GL-EGF水凝胶与RBCs共孵育均表现出较低的溶血率(<5%)。其上清液颜色:NaCl组、CMC-GL-2和CMC-GL-EGF水凝胶组血细胞均未破裂,上清液颜色为无色透明,而使用Tris-X100处理血细胞均已破裂释放血红蛋白,上清液颜色为鲜艳的红色。L929细胞在不同浓度CMC-GL和CMC-GL-EGF水凝胶处理下均表现出较低的细胞毒性,细胞存活率均高于90%。(4)与NS组相比,水凝胶/表皮细胞生长因子(GEL/EGF)、表皮细胞生长因子(EGF)均对创面愈合有促进作用,单纯使用水凝胶(GEL)对创面有阻止其收缩的作用。损伤后第3天,NS组显示伤口有出血和炎症的迹象,图6A显示。给予不同治疗后第7天,老年组的愈合率分别:52.05%±4.32、55.17%±2.45、50.92%±2.77、69.34%±1.53,中年组的愈合率分别:68.41%±0.79、73.40%+2.81、56.23%±4.49、79.62%±0.69,青年组的愈合率分别:84.91%±0.31、85.79%±0.28、79.39%±2.13、86.09%±0.46,幼年组的愈合率分别:85.12%±0.35、86.91%±0.36、79.93%±2.37、86.13%±0.32。结果提示在外源性EGF对创面愈合的促进作用存在年龄相关性增强。(5)第7天和第14天切片的H&E染色显示,EGF与GEL-EGF治疗组的肉芽组织质量和表皮/真皮成熟度与其他组无显著性差异。GEL-EGF(high)治疗组的愈合反应增强;在第14天,观察到这些组的伤口成熟加快,表皮形成良好,伴有紧密的正角化。然而,GEL-EGF组有许多组织良好的肉芽组织。此外,NS和GEL处理的创面显示更多的炎性肉芽组织和表皮的不完全上皮化,覆盖的血痂直到伤后第十四天。4不同年龄大鼠不同深度的烫伤模型的建立(1)在恒温恒压强条件下,大鼠烫伤模型制备条件:1月龄,深Ⅱ度:3 s,Ⅲ度:5 s;2月龄,浅Ⅱ度:3 s,深Ⅱ度:5 s,Ⅲ度:7 s、9 s;12和112月龄,浅Ⅱ度:3 s、5 s,深Ⅱ度:7 s、9 s,Ⅲ度:11 s、13 s。(2)在恒温恒压强下,采用直径分别为1、1.5、2 cm,高度2 cm的金属柱,沸水浴加热后,在大鼠背部烫伤5 s,模型烫伤深度一致,均为深Ⅱ度烫伤。结论1.随着年龄增长,来自表皮层基底部的角质形成细胞祖细胞的量没有发生明显的变化,EGFR表达量则出现年龄相关性降低,说明表皮层具有干性的细胞的增殖分化能力降低了,导致表皮层厚度随年龄增长逐渐变薄。JAK2/STAT3/SOCs3信号转导在正常皮肤组织中出现了年龄相关性改变,SOCs3表达呈年龄相关性增加,通过抑制JAK2的表达,对JAK2/STAT3/SOCs3信号转导产生抑制作用。2.大鼠创面愈合能力出现年龄相关性降低,自然衰老的SD大鼠创面愈合能力明显减退。在正常情况下,表皮层基底部的CD271+细胞无明显年龄相关性统计学差异。在大鼠创面愈合过程中,CD271+细胞通过增殖迁移完成创面再上皮化,同时分化形成角质细胞。在这个过程中,新生上皮的CD271+细胞的比例并没有出现年龄相关性改变。然而,在正常情况下表皮细胞表达量呈年龄相关性降低的EGFR,在大鼠创面愈合过程中被部分激活,且EGFR~+细胞增殖,表皮厚度增加。在这个过程中,幼年和青年组表皮细胞EGFR表达无明显改变,中年和老年组EGFR则在创伤刺激下表达增强,接近幼年和青年组水平,EGFR~+表皮细胞层的厚度增加呈年龄相关性降低。在正常情况下呈年龄相关性增加的SOCs3,在创伤后表达量增加,且其表达量也呈现年龄相关性变化。创面愈合能力的年龄相关性降低与SOCs3表达增加有关。SOCs3表达增强抑制了EGFR/JAK2/STAT3信号转导,使表皮EGFR~+细胞的增殖出现年龄相关性降低,从而影响创面愈合。3本研究构建的CMC-GL水凝胶包被EGF具有良好的缓释效果。在采用水凝胶缓释EGF治疗老年大鼠创面愈合延迟中,能够通过持续的一定剂量的药物释放,对创面愈合进行有效治疗。同时我们猜测EGF通过缓释,刺激创面常驻细胞合成并分泌EGF、bFGF、vEGF增强基底膜和细胞外基质成分的合成、细胞迁移和增殖。4.该实验探索了不同年龄大鼠的烫伤模型的制备方法,可以通过调整致伤时间及模块直径的调整制备出烫伤深度划分准确且创面大小可调节的不同年龄大鼠不同烫伤深度的烫伤模型。该方法能够制备出烫伤深度准确的简易烫伤模型,是研究烫伤修复机制与年龄的相关性及评价烫伤治疗新方法研究的良好模型。