食用菌病毒的鉴定及脱除研究

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全世界食用菌共有500多品种,其中我国报道的已有350多种。目前,我国食用菌的产量占世界总量的65%,居世界各国之首。病毒病是食用菌生产中的重要问题,缺少简单有效的鉴定及控制手段。本研究探索建立一套从食用菌中提取病毒特异dsRNA,利用DOP-PCR分析病毒基因组序列信息,再进行脱毒处理、获得无病毒菌株的技术体系。1、利用改进SDS法分别从平菇组织和牛肝菌菌丝中提取出了病毒特异dsRNA。提取出平菇病毒特异dsRNA片段分别为2.5kb、2.0kb和1.8kb;且病毒dsRNA的特点显示其与国外报道的平菇病毒dsRNA一致。建立从平菇组织中提取病毒dsRNA的技术体系,该技术可有效对平菇中的病毒进行鉴定。提取出的牛肝菌病毒特异dsRNA片段分别为2.0kb、1.6kb和1.4kb,目前尚未见牛肝菌病毒病毒的报道,因而尚不能对该病毒进行鉴定。对市售平菇进行了病毒鉴定,其中较多受病毒侵染,说明该病毒可能已在国内随菌种销售而广泛扩散。2、以dsRNA为模板,利用DOP-PCR技术对病毒部分基因组进行非特异扩增。对DOP-PCR产物进行了克隆测序,平菇病毒特异dsRNA PCR产物测序共获得了7个序列,序列长度约为300~500bp。利用BLAST程序,基于核苷酸及推导氨基酸序列进行了BLAST分析;在GenBank数据库中未能找到与上述序列相似度较高的序列(相似度大于80%),仅与一些真菌蛋白的氨基酸序列有一定的相似性(相似性大于30%)。其中,仅一个序列(克隆编号C09样本)发现与病毒特异序列存在较高相似性。克隆C09共1100bp,其序列前部分(85bp)与黄瓜花叶病毒RNA1的非编码区的序列相似性为97%,但其他区域序列未能在GenBank数据库中找到序列相似性较高的序列。总体来看,克隆C09可能为真菌病毒特异序列,但由于目前已报道的真菌病毒序列较少,因而未能在数据库中搜索到序列相似性较高的序列。3、分别采用化学药剂-菌丝尖端处理、低温-菌丝尖端处理和高温-菌丝尖端处理对平菇、牛肝菌中的菌株进行了脱毒处理,其中高温-菌丝尖端脱除处理两种菌株的效果最好,可有效脱除平菇、牛肝菌的病毒dsRNA;病毒唑、放线菌酮及病毒唑与盐酸吗啉胍联合菌丝尖端脱除处理,使病毒dsRNA条带减弱,可能干扰了病毒的复制,但其具体机制尚不了解。4、对脱毒菌株、出发菌株的生长特性及产漆酶、羧甲基纤维素酶特性进行了分析。结果显示,脱毒菌株生长势优于有毒菌株;漆酶、羧甲基纤维素酶活性皆显著提高。总体上说明菌株经脱毒后,其漆酶酶活、羧甲基纤维素酶酶活皆升高,说明其代谢活动可能增强,从而促进菌丝生长。
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