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目的:宫颈癌严重威胁着女性的健康,高危型HPV（HR-HPV）持续感染是宫颈癌的主要病因但不是唯一因素。随着微生态与肿瘤关系研究的深入,越来越多的研究提示HPV的持续感染和宫颈病变的发生与阴道菌群的多样性密切相关。Toll受体9（TLR9）作为微生物未甲基化CpG基序的特异性受体,与胃癌、肺癌等癌症的发生有关,但TLR9与宫颈病变的关系目前尚无定论,在宫颈病变的发生发展中,阴道菌群与TLR9的相互关系尚不明确。鉴于TLR9具有识别和特异性结合微生物未甲基化CpG基序的生物学特性,我们提出阴道菌群紊乱可导致菌群未甲基化CpG基序水平的改变,进而引发TLR9表达及功能异常,在宫颈病变中发挥作用的假设。据此,本研究以正常宫颈妇女（NC）、低度宫颈上皮内瘤变患者（CIN 1）、高度宫颈上皮内瘤变患者（CIN2/3）以及宫颈鳞状细胞癌（SCC）患者为研究对象,形成宫颈癌变发生发展的人群自然阶梯。在探讨阴道菌群紊乱和TLR9异常表达与宫颈病变关系的基础上,深入分析阴道菌群紊乱和菌群CpG基序含量与TLR9表达的关系,揭示不同宫颈病变中阴道菌群紊乱与TLR9表达的相互关系,以期为宫颈病变的病因研究提供新的科学依据,为宫颈病变进展的预测预警提供生物学标志。方法:在山西医科大学第二附属医院妇产科门诊于2017年4月-2018年8月就诊的妇女中,按照严格的纳入和排除标准,选取经液基细胞学（TCT）检查异常继而经病理学确诊的NC妇女124例、CIN 1患者90例、CIN 2/3患者78例以及SCC患者49例为本次的研究对象。在收集研究对象一般人口学特征及宫颈病变相关因素的基础上,采集研究对象的宫颈脱落细胞、阴道分泌物以及宫颈组织。采用导流杂交法进行HPV分型检测,利用RT-PCR法、Western-blot法分别检测TLR9 mRNA、TLR9蛋白的表达水平。进一步对研究对象选择2周内未使用抗生素、3天内无阴道用药或冲洗的妇女,经年龄匹配后,最终获得NC妇女22例,CIN 1患者22例、CIN 2/3患者19例以及SCC患者10例,进行高通量16s r DNA测序。采用SPSS23.0软件对资料进行c2检验、方差分析、Kruskal-Wallis H检验以及Logistic回归分析,利用LEf Se、Userach、Mothur以及R 4.0等软件进行阴道菌群生物信息学分析,应用in silico网络平台提供的数据库及在线分析程序,获得各菌株CpG基序含量。使用Graph Pad 8.0.2绘制统计图。结果:1.阴道菌群紊乱与宫颈病变的关系:菌群Alpha多样性在NC、CIN 1、CIN 2/3和SCC组差异具有统计学意义（F=6.387,P=0.001）,且随着病变进展呈逐渐增加趋势(c2趋势=7.841,P=0.005)。Beta多样性分析也显示,各病变组与NC组的细菌群落差异随病变进展逐渐显著。采用LEf Se分析发现不同宫颈病变妇女其特征菌属有较大差别,乳酸杆菌属（Lactobacillus）、代尔夫特菌属（Delftia）和糖酵解菌属（Saccharifermentans）分别为NC、CIN 1和CIN 2/3组特征菌属,而梭菌属（Clostridia）、嗜胨菌属（Peptoniphilus）等为SCC组的特征菌属。不同宫颈病变组菌群的分布分析显示,乳酸杆菌属（Lactobacillus）在NC、CIN 1、CIN 2/3和SCC组的构成比分别为79.42%、63.63%、58.35%和12.32%,随宫颈病变的进展逐渐降低,而嗜胨菌属（Peptoniphilus）、普雷沃菌属（Prevotella）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）和厌氧球菌（Anaeroco CAus）等致病菌属的构成比逐渐增加。2.TLR9表达与宫颈病变的关系:TLR9 mRNA（H=16.334,P=0.001）和蛋白（F=15.583,P<0.001）的表达水平在不同宫颈病变组差异均有统计学意义。组间多重比较发现,NC、CIN 1和CIN 2/3组TLR9 mRNA均高于SCC组,而TLR9蛋白均低于SCC组,随着宫颈病变程度的加重,TLR9蛋白的表达逐渐升高(c2趋势=18.755,P<0.001),而mRNA未见相似趋势(c2趋势=2.693,P=0.101)。进一步以HPV感染状态进行分层分析,结果显示,HR-HPV阳性组TLR9蛋白的表达明显高于阴性组（t=21.79,P<0.001）,在HR-HPV阳性组中,随着宫颈病变的进展TLR9蛋白表达呈上升趋势(c2趋势=11.44,P=0.006),而HR-HPV阴性组未显示类似结果。3.TLR9蛋白与阴道菌群在宫颈病变中的相互关系:TLR9蛋白表达与菌群多样性呈正相关关系（rs=0.26,P=0.03）。TLR9蛋白高表达组的优势菌属为乳酸杆菌属（Lactobacillus,44.88%）和加德纳菌属（Gardnerella,20.00%）,TLR9蛋白低表达组的优势菌属则为乳酸杆菌属（Lactobacillus,86.78%）。进一步分析不同宫颈病变组中TLR9蛋白与菌群的分布发现,在NC组,TLR9蛋白高表达和低表达妇女的优势菌属均为乳酸杆菌属（Lactobacillus）,比例分别为61.18%和99.55%;在CIN组,TLR9蛋白高表达妇女排名前三位的菌属依次为乳酸杆菌属（Lactobacillus,49.75%）、加德纳菌属（Gardnerella,24.83%）和奇异菌属（Atopobium,8.25%）,TLR 9蛋白低表达组则为乳酸杆菌属（Lactobacillus,82.75%）;SCC组,TLR9蛋白高表达妇女的优势菌属为加德纳菌属（Gardnerella,69.82%）,TLR9蛋白低表达组排名前三位的菌属依次为嗜胨菌属（Peptoniphilus,22.08%）、乳酸杆菌属（Lactobacillus,13.23%）和卟啉单胞菌属（Porphyromonas,11.55%）。4.菌群CpG基序含量与TLR9蛋白的关系:阴道菌群CpG基序含量与TLR9蛋白的表达呈正相关关系（r=0.97,P=0.034）,随着宫颈病变的进展,TLR9蛋白的平均表达水平均随着优势菌属CpG基序含量的升高而上升。结论:1.阴道菌群紊乱与宫颈病变密切相关,随着宫颈病变的进展,菌群多样性增加,阴道乳酸杆菌属构成比逐渐减低,而嗜胨菌属等致病菌构成比逐渐升高。嗜胨菌属为SCC组的特征菌,且丰度最高。提示加强阴道菌群的检测,维持乳酸杆菌在阴道菌群的优势地位,调节阴道微生态平衡,对于阻止宫颈病变的发生发展具有重要意义。嗜胨菌属对宫颈病变的恶性转化可能具有重要预警作用。2.TLR9蛋白表达的异常升高可增加宫颈病变的风险,且随着宫颈病变进展呈现逐渐增加的趋势,尤其在HR-HPV感染的女性中这种效应更为明显。提示,TLR9蛋白不仅可作为宫颈病变发生发展的潜在生物标志,而且为TLR9用于宫颈病变的临床干预开拓了新思路。3.阴道菌群多样性增加、菌群构成发生变化,均可能促进TLR9的表达,且随着宫颈病变进展,TLR9表达水平随菌群CpG基序含量的升高而增加。提示,阴道菌群紊乱可能导致菌群CpG基序含量的改变,继而诱发TLR9的异常高表达,促进宫颈病变的发生发展。同时,TLR9可作为评价阴道菌群变化的重要指标,为宫颈病变的早期筛查和疾病进展的监测及预警提供了便捷手段。