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RAS相关蛋白家族成员Rap2b是一种新发现的p53下游靶基因。当p53+/+细胞受到外源性刺激时(如阿霉素给药),p53被激活,导致细胞内Rap2b蛋白的表达量显著增加,从而促进肿瘤细胞的生存。我们推测,Rap2b是一个有效的肿瘤治疗靶点。为此,本文设计了一种以纳米材料为载体的药物/基因递送系统,用于评估Rap2b siRNA作为一种抗肿瘤治疗药物的潜力。同时本文通过研究Rap2b与p53之间的相互作用,为阐明Rap2bsiRNA的抗肿瘤机制提供重要线索。首先,为了便于后续实验,我们制备了 Rap2b单克隆抗体。共得到八个单克隆抗体稳定细胞株。酶联免疫吸附实验结果显示八株均为IgG1类抗体。同时免疫印迹法结果显示抗体的最低使用浓度为0.1 μg/mL,所能检测到的蛋白最低量为5 ng。然后,我们通过氯金酸法合成了金纳米壳颗粒,并将合成的Rap2bsiRNA和阿霉素连接到金纳米壳上。纳米粒子与HCT116细胞共孵育后,在荧光显微镜下可见装载有阿霉素和Rap2b siRNA的金纳米壳被肿瘤细胞吸收。激光照射能显著促进金纳米壳释放阿霉素和Rap2b siRNA,而且释放的Rap2b siRNA能显著降低细胞内Rap2b的表达水平。接着,我们通过体外和体内实验评价了不同药物联用对肿瘤细胞的杀伤效应。结果显示,降低Rap2b的表达水平能显著增强阿霉素对于肿瘤细胞的杀伤效果。同时,激光照射纳米粒子产生的热能能对肿瘤细胞产生额外的杀伤作用,进一步提高了阿霉素的肿瘤治疗效果。最后,我们通过体外GST pulldown实验和体内双分子荧光互补实验证明了 Rap2b与p53之间存在直接相互作用。为了确定这两种蛋白互作的结构域,我们构建了一系列Rap2b和p53的截短突变体,再通过体外GSTpullldown实验和双分子荧光互补实验确定了 Rap2b的第41-135位氨基酸残基和p53的DNA结合结构域是二者直接相互作用的区域。综上所述,本研究证明了 Rap2b siRNA能显著增强阿霉素的抗肿瘤疗效,而且Rap2b能与p53直接结合,推测Rap2b可能通过与p53直接结合而负反馈调控p53的活性。这些发现有助于深入理解Rap2b和p53在肿瘤发生发展和耐药性形成中的作用,为抗肿瘤药物的研发提供了新靶点,对于恶性肿瘤的防治具有重要意义。