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目的:随着非酒精性脂肪肝(NAFLD)患病率的逐年增长,其已成为全球最常见的慢性肝病。到目前为止,NAFLD尚无有效的治疗方法,生活方式干预依然是其主要治疗策略,药物如二甲双胍、吡格列酮和维生素E等对NAFLD的治疗效果有限。因此,急需针对NAFLD治疗药物的研发。人参的主要活性成分人参皂苷Rg1被发现具有抗肿瘤、抗氧化和抗糖尿病等多种药理作用。在前期的研究中,本课题组发现人参皂苷Rg1可显著降低NAFLD模型小鼠甘油三酯和游离脂肪酸水平,减轻肝组织脂肪变,提示人参皂苷Rg1对改善肝脏脂质蓄积具有积极作用。本研究旨在既往研究的基础上,进一步探讨人参皂苷Rg1改善NAFLD脂质代谢的可能机制及作用靶点,为NAFLD的治疗提供新的思路。方法:1.细胞造模与分组:接种Hep G2细胞于6孔板,当6孔板内细胞密度达到60%-70%时分为3组,分别予以不同处理。正常组:普通培养基培养(含等浓度溶解介质);模型组:1 mmol/L游离脂肪酸(FFA)培养基[FFA为油酸(OA)和棕榈酸(PA)混合物(OA:PA=2:1)]培养24 h后继以普通培养基培养24 h;人参皂苷Rg1组:1 mmol/L FFA培养基培养24 h,继以25μM和50μM人参皂苷Rg1培养基培养24 h。2.CCK8法检测人参皂苷Rg1的细胞毒性作用;油红O染色法观测脂滴蓄积水平;微量法检测细胞内TG、TC、MDA和SOD含量;RT-q PCR及Western blot检测与脂质合成、摄取、氧化和输出相关基因的表达情况。3.采用SPSS20.0分析数据,所有数据均以X±SD表示。所有数据进行正态性检验及单因素方差分析,采用SNK-q法进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.人参皂苷Rg1的细胞毒性作用:Hep G2细胞活性随人参皂苷Rg1浓度的增加而逐渐降低。25μM浓度时,人参皂苷Rg1对Hep G2细胞活力无明显影响(P<0.05),当浓度达到75μM时,细胞存活率显著降低(P<0.05)。因此,选择25μM和50μM浓度的人参皂苷Rg1进行后续试验,以避免其细胞毒性所致的抑制作用。2.人参皂苷Rg1改善FFA诱导的Hep G2细胞脂质蓄积:油红O染色结果表明,相比于正常组,模型组细胞A(485nm)值增加,细胞内脂滴聚集显著增多,呈较大的圆颗粒状,提示NAFLD模型构建成功(P<0.01)。与模型组比较,人参皂苷Rg1组A(485nm)值均降低,细胞内脂滴均减少(P<0.01)。微量法测定细胞内TG和TC含量显示,模型组细胞内TG和TC含量较对照组显著增加(P<0.01)。经25μM与50μM浓度人参皂苷Rg1处理后,细胞内TG和TC含量均降低(P<0.01)。3.人参皂苷Rg1对FFA诱导的Hep G2细胞MDA和SOD的影响:结果显示,与对照组比较,模型组SOD含量下降,MDA含量升高(P<0.01)。与模型组比较,不同浓度人参皂苷Rg1组均可升高SOD含量,降低MDA含量,50μM浓度时效果最显著(P<0.01)。4.人参皂苷Rg1对FFA诱导的Hep G2细胞脂质合成相关基因表达的影响:Western blot结果显示,模型组SREBP1c和FASN表达均升高(P<0.01);25μM和50μM浓度人参皂苷Rg1组的SREBP1c和FASN表达均降低(P<0.01)。此外,模型组ACCα表达变化不明显(P>0.05),但ACCα的磷酸化显著降低(P<0.05),并且ACCα的磷酸化与ACCα比值显著降低(P<0.05)。人参皂苷Rg1处理后,ACCα磷酸化均显著升高(P<0.05),50μM浓度人参皂苷Rg1组磷酸化ACCα与ACCα比值显著升高(P<0.05)。RT-q PCR结果显示,模型组SREBP1c、FASN和ACCα表达均升高(P<0.05)。人参皂苷Rg1组SREBP1c,FASN和ACCα表达均下降,50μM浓度时效果最显著(P<0.05)。5.人参皂苷Rg1对FFA诱导的Hep G2细胞脂质摄取相关基因表达的影响:Western blot结果显示,模型组CD36、FATP2、FATP5和FABP1蛋白的表达均升高(P<0.05)。25μM和50μM人参皂苷Rg1组CD36和FATP5蛋白的表达均降低(P<0.05)。50μM人参皂苷Rg1组FATP2和FABP1蛋白表达均下降(P<0.05),但25μM浓度时下降均不明显(P>0.05)。RT-q PCR检测转录水平脂质摄取相关基因的表达结果显示,模型组的CD36、FATP2、FATP5和FABP1均升高(P<0.01)。经不同浓度人参皂苷Rg1处理后CD36、FATP2、FATP5和FABP1 m RNA表达均降低(P<0.01)。6.人参皂苷Rg1对FFA诱导的Hep G2细胞脂质氧化相关基因表达的影响:Western blot结果显示,模型组CPT1和ACOX1表达均降低(P<0.05)。人参皂苷Rg1组CPT1和ACOX1表达均升高,50μM浓度时最显著(P<0.05)。RT-q PCR结果与Western blot结果一致,模型组CPT1和ACOX1 m RNA表达均下降(P<0.05)。50μM浓度时人参皂苷Rg1组CPT1和ACOX1 m RNA表达均上升(P<0.05)。7.人参皂苷Rg1对FFA诱导的Hep G2细胞脂质输出相关基因表达的影响:Western blot结果显示,模型组MTTP和Apo B100蛋白表达均降低(P<0.01)。50μM浓度人参皂苷Rg1组MTTP和Apo B100表达均升高(P<0.05)。RT-q PCR结果表明,模型组MTTP和Apo B100表达均降低(P<0.05)。不同浓度人参皂苷Rg1组MTTP m RNA表达均升高(P<0.05),50μM人参皂苷Rg1组Apo B100 m RNA表达升高(P<0.01)。8.人参皂苷Rg1对转录因子PPARα和PPARγ的影响:RT-q PCR与Western blot结果显示,模型组PPARα的蛋白和m RNA表达均下降(P<0.05)。人参皂苷Rg1组PPARα蛋白与m RNA表达均上升(P<0.01)。PPARγ蛋白和m RNA的表达情况与PPARα完全相反。模型组PPARγ的蛋白与m RNA表达均升高(P<0.01)。人参皂苷Rg1组PPARγ蛋白与m RNA表达均降低(P<0.01)。结论:1.人参皂苷Rg1能够降低FFA诱导的Hep G2细胞脂质蓄积模型TG和TC含量,减轻细胞脂质沉积,改善细胞脂肪变。2.人参皂苷Rg1能够降低FFA处理的Hep G2细胞MDA含量,提升SOD活力,具有抗氧化及改善脂质过氧化的作用。3.人参皂苷Rg1可通过抑制PPARγ的表达抑制脂质摄取与合成,从而减少脂质的流入,减轻肝细胞脂质蓄积。4.人参皂苷Rg1可通过增强PPARα的表达促进脂质氧化与输出,从而增强脂质的输出,改善肝细胞脂质变性。