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流行性乙型脑炎,又称日本乙型脑炎,是一种由虫媒介导传播的人兽共患病。给人类健康和生猪养殖业带来巨大危害,接种疫苗是防治该病的主要手段。目前国内猪乙型脑炎疫苗毒株都是基因Ⅲ型,随着优势基因型从Ⅲ型逐步转换成Ⅰ型,开发基因Ⅰ型疫苗显得尤为迫切,本研究是通过制备基因Ⅰ型乙型脑炎病毒灭活苗,筛选出具有优秀免疫原性的候选毒株。成功制备出了灭活苗,并通过小鼠免疫试验、豚鼠免疫试验、小鼠攻毒保护试验和仔猪免疫试验初步筛选出两株免疫原性较好的毒株。1.分离株的鉴定和毒株初步筛选1)分离株生物学特征研究:通过对病毒的复苏,得到能够稳定传代的四株(YA1、YA2、MY]、CZ1株)病毒,经过RT-PCR鉴定为乙型脑炎病毒。在BHK-21细胞和鼠脑传代制备出了不同的病毒液,通过测定四种毒株的TCID50和LD50发现鼠脑传代后的病毒TCID50显著升高,LD50显著下降。病毒在BHK-21细胞传达后滴度在104.6-105.8TCID50/0.2ml之间,鼠脑传代后病毒滴度显著上升,达到1011.8-1012.3TCID50/0.2ml,细胞传代后半数致死量在10-3.5-10-4.2/0.025ml之间,鼠脑传代后半数致死量显著下降,LD50在10-7.3-10-6.3/0.025ml之间,因此选择鼠脑病毒液作为制备灭活苗的病毒液。2)灭活苗的制备:将制备好的鼠脑病毒液通过甲醛灭活,通过灭活条件的优化实验,确立了 0.05%甲醛在37℃灭活48h的最佳灭活条件,通过剂型检验、稳定性检验、无菌检验和安全性检验制备出了质量合格的四种毒株鼠脑灭活苗。3)毒株初步筛选:在制备出合格疫苗的基础上,开展小鼠免疫试验,通过腹腔接种后监测小鼠血清JEV抗体水平,初步筛选免疫原性较好的毒株。结果显示四种毒株制备的疫苗都具有良好的免疫原性,在二免后两周YA1株和CZ1株组的小鼠抗体水平显著高于商品化灭活苗组(P<0.01),在二免后4周所有分离株组的小鼠抗体水平都显著高于商品化灭活苗组(P<0.01),但在绝对数值上YA1株和CZ1株组小鼠抗体水平更高,初步筛选出免疫原性较优的YA1株和CZ1株。2.候选毒株免疫原性研究1)豚鼠免疫试验:在初步筛选出YA1株和CZ1株后,开展了豚鼠免疫试验进一步评价了两毒株作为猪乙型脑炎灭活苗候选毒株的可能性,豚鼠试验显示CZ1株和YA1株都能使100%的豚鼠产生合格的血凝抑制抗体,相对于商品化灭活苗阳性转化率更高、血凝抑制抗体效价也更高,二者之间CZ1株组豚鼠产生的血凝抑制抗体水平显著高于YA1株组(P<0.05)。2)小鼠攻毒保护试验:疫苗在免疫3周龄小鼠后1周加强免疫一次,二免后1周使用1OLD50脑内攻毒,结果显示YA1株疫苗对小鼠的保护率为70%,CZ1株疫苗对小鼠的保护率为80%,而商品化的鼠脑灭活苗和减毒活疫苗的保护率分别为60%和70%。两毒株都显示出了优良的保护力,CZ1株的保护力则更优。3)仔猪免疫试验:仔猪免疫试验结果显示两个毒株都能使仔猪的抗体阳性转化率达到100%,相对于商品化灭活苗抗体水平和中和抗体效价更高。同时抗体水平与前文的豚鼠免疫试验、小鼠攻毒保护试验结果相符,二者之间CZ1株的免疫原性更好。