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赤潮藻类的鉴定是治理赤潮的关键步骤。目前,利用分子生物学手段检测微藻的方法日渐成熟,许多学者通过对核糖体rDNA序列分析成功进行了分子鉴定。据报道米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)和环状异帽藻(Heterocapsa Circularisquama)属于2种外来入侵赤潮藻类,该两种藻入侵可能与船舶压舱水传播有关。本研究通过对两种外来入侵赤潮藻的培养,结合传统鉴定方法和PCR、环介导等温扩增(LAMP)法等方法进行定性分析,初步构建了这两种外来入侵赤潮藻的分子鉴定方法,为控制外来入侵赤潮物种,赤潮的快速预报和治理提供技术支撑。
本文主要包括以下方面:
一、概述赤潮的产生、危害、分类、成因,我国赤潮状况及赤潮生物鉴定研究历史和国内外研究现状。在利用分子生物学鉴定方面,概括了PCR、LAMP等鉴定技术的研究概况。
二、对赤潮多发藻米氏凯伦藻核糖体18S rDNA及其转录间隔(ITS)区序列PCR扩增后测序,获得18S rDNA和ITS基因序列。结合12种甲藻和1种硅藻作序列比较分析,以寻找适宜设计特异性引物探针区域.并用邻接法构建系统进化树,研究各藻种间亲缘关系。结果表明以18S rDNA与ITS序列构建的进化树拓扑结构相一致,18S rDNA序列相对保守,适合进行属以上关系的系统进化分析,而ITS序列变异较大,适合种属间鉴别分析,且ITS1和ITS2是变异很大的区域,适合种间的分子特异性鉴定。
三、利用核糖体转录间隔区(ITS)区分别设计出针对两种外来入侵赤潮藻米氏凯伦藻和环状异帽藻的特异性PCR扩增引物,通过筛选,选择最佳引物Ki1F3/Ki1B3、YiF3a/YiB3a。以链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)、立玛原甲藻(Prorocentrum lima)、牟氏角毛藻(Chaetoceros muellerii)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)作为阴性对照,做进一步PCR验证,为赤潮的预测预报提供分子鉴定基础。
四、利用环介导恒温扩增(LAMP)技术成功检测了外来入侵赤潮藻米氏凯伦藻基因,并对其反应程序和反应体系进行了优化,建立起一种简单快速的微藻检测技术。利用本实验优化体系对米氏凯伦藻进行了LAMP扩增,得到了理想的扩增产物,同时与其他8种藻类做阴性对照实验,只有米氏凯伦藻为特异性扩增,其他藻类均呈现阴性反应。另外,对扩增终产物进一步进行酶切分析,并与以F3和B3为引物的PCR扩增的片段相比较,均与预期结果相吻合。采用2种方法进行肉眼检测阳性反应结果,阳性反应管内可见白色焦磷酸镁沉淀,与SYBR GreenⅠ反应呈现绿色。本文首次将LAMP技术应用于米氏凯伦藻的快速检测,初步建立了外来入侵藻类的快速检测方法,有望应用到赤潮藻类的现场检测,在赤潮的预测预报中发挥强大作用。