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第一部分小胶质细胞密度及活化参与决定氧诱导视网膜病变模型中视网膜新生血管的生成研究背景:早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)是造成婴幼儿视力丧失的主要原因,其主要的病理改变是病理性增生的视网膜新生血管(retinal neovascularization,RNV)。近年研究发现,作为炎症介质的小胶质细胞可能参与决定着视网膜新生血管的生成。目的:探讨视网膜小胶质细胞密度和激活状态对氧诱导视网膜病变模型中新生血管生成的影响。方法:分别选用C57BL/6J小鼠,Balb/c小鼠和SD大鼠,于生后第7天(P7)至P12与母鼠共同置于体积分数(75±2)%高氧氧箱中饲养,于P12返回常氧环境中,进行氧诱导视网膜病变(oxygen induced retinopathy,OIR)模型的建立。对Balb/c OIR小鼠使用腹腔注射米诺环素(minocycline)抑制小胶质细胞(microglia)的激活,使用氯膦酸盐脂质体进行玻璃体腔注射以减少视网膜小胶质细胞密度,使用免疫荧光染色,RT-qPCR及Western-blot法等检测视网膜中各种胶质细胞的密度和活化程度,用以检测抑制小胶质细胞激活或减少胶质细胞密度的效果,使用视网膜铺片Lectin染色观察两种药物对视网膜新生血管生成的影响。结果:常氧环境中Balb/c小鼠和C57BL/6J小鼠的视网膜血管发育情况基本相同,在OIR模型中,P12天,Balb/c OIR小鼠和C57BL/6JOIR小鼠的视网膜无血管区面积大小相同,二者无统计学差异(P>0.05),在P14天时可见Balb/c OIR小鼠的视网膜无血管区显著小于C57BL/6J OIR小鼠(P<0.001),在P17天时Balb/c OIR小鼠视网膜中不存在无血管和新生血管区域,而C57BL/6JOIR小鼠视网膜中存在中央无血管灌注区,并有中周部无灌注区边缘有新生血管生成。免疫荧光检测胶质细胞的密度,发现Balb/c小鼠的小胶质细胞和星形胶质细胞密度均较高。米诺环素和氯膦酸盐脂质体减少Balb/c小鼠的小胶质细胞激活或者密度后,发现Balb/c OIR小鼠在P14天时视网膜中的无血管区面积更大(P<0.01),且在P17天视网膜中依然存有部分无血管区,并可见小面积的新生血管簇。检测小胶质细胞标记物Iba1,星形胶质细胞和Muller细胞标记物GFAP的表达后,我们发现米诺环素和氯膦酸盐脂质体可以抑制小胶质细胞的活化或降低小胶质细胞的密度(P均<0.05),而它们对星形胶质细胞及Muller细胞的数量没有显著影响(P均>0.05)。结论:视网膜中高密度小胶质细胞可以在一定程度上减轻OIR小鼠视网膜血管病变。第二部分小胶质细胞外泌体减轻氧诱导视网膜病变中光感受器细胞损伤及抑制视网膜新生血管生成的研究研究背景:通过第一部分的研究我们发现视网膜中小胶质细胞的密度或活化状态可以在一定程度上决定OIR小鼠视网膜血管病变的程度,然而相关的具体机制尚不清楚。近年研究发现中枢神经系统的小胶质细胞外泌体对于部分疾病具有保护性作用,而视网膜小胶质细胞外泌体在氧诱导视网膜病变中的作用尚不明确,需要进一步探索及阐明。目的:探讨小胶质细胞外泌体在ROP中的作用及其机制。方法:体外培养小胶质细胞,提取小胶质细胞外泌体,进行玻璃体腔注射,观察C57BL/6J OIR小鼠视网膜中无血管区和新生血管生成情况,以及相关促血管生长因子的表达水平,并使用视网膜电图(electroretinogram,ERG)检测视网膜功能变化。缺氧环境下培养光感受器细胞,使用流式细胞术检测细胞凋亡水平,RT-qPCR及Western-blot检测光感受器细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)状态,并检测加入小胶质细胞外泌体后的光感受器细胞凋亡及内质网应激状态。使用高通量测序检测小胶质细胞外泌体中高表达的miRNA,分析并使用RT-qPCR及Western-blot验证其与ER stress及凋亡的关系。最后,使用体外管腔形成实验检测小胶质细胞外泌体培养的光感受器细胞对血管内皮细胞管腔形成能力的影响。结果:使用小胶质细胞外泌体进行玻璃体腔注射的OIR小鼠,在P16和P17天视网膜中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA 和蛋白表达水平降低(P<0.05),外泌体处理的OIR小鼠表现出较小的无血管区域面积(P<0.001)和较少的新生血管簇(P<0.001)。此外,外泌体注射的OIR小鼠,视网膜中光感受器细胞凋亡减轻(P<0.01),且视网膜电图结果显示视网膜功能得到了改善。体外结果发现,小胶质细胞的外泌体能够进入光感受器细胞细胞内,通过抑制肌醇的酶 1α(inositol requiring transmembranekinase/endonuclease1α,IRE1α)-X-盒结合蛋白1(X-boxbinding protein 1,XBP1)级联反应,减轻缺氧诱导的光感受器细胞凋亡。microRNA高通量测序结果显示,小胶质细胞外泌体中富含miR-24-3p,能够靶向抑制IRE1α的表达,进而抑制下游XBP1表达,c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)磷酸化及CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)等分子的表达,减轻了缺氧诱导的光感受器细胞凋亡。此外,小胶质细胞外泌体能够显著下调缺氧环境下的光感受器中VEGF和转化生长因子-β(transforming growth factor beta,TGF-β)的mRNA和蛋白质水平(P均<0.05),且使用小胶质细胞外泌体培养的缺氧光感受器细胞体外促进血管内皮细胞管腔形成的能力较未使用组下降(P<0.05)。结论:小胶质细胞外泌体能够减轻ROP动物模型中的血管病变和光感受器细胞损伤。小胶质细胞的外泌体能够通过转移外泌体中的miR-24-3p进入光感受器细胞中,进而抑制ER stress和IRE1α-XBP1/JNK-CHOP信号通路的激活并减轻缺氧诱导的光感受器细胞凋亡。小胶质细胞外泌体还可以通过抑制缺氧的光感受器细胞中促血管生成因子,包括VEGF和TGF-β的表达进而抑制新生血管的生成。这些结果表明小胶质细胞在氧诱导视网膜病变中发挥保护作用,而小胶质细胞外泌体可能是发挥保护作用的重要途径。