偏肿革裥菌在两种半纤维素处理下的多组学分析及关键基因鉴定

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半纤维素是自然界中除纤维素外第二大丰富的结构多糖,广泛存在于植物细胞壁中,与纤维素、木质素共同组成木质纤维素,是地球上丰富的可再生能源。半纤维素可以直接或间接应用于食品、医药、化工等多个领域,因此半纤维素的降解与利用技术也成为研究领域关注的热点。白腐菌是一种木材腐朽菌,分布范围广且数量较多,具备丰富的胞外酶系统,对木质素、纤维素和半纤维素这三种木质纤维成分均可以降解,已成为当下最受关注的微生物之一。偏肿革裥菌(Lenzites gibbosa)是一种生长速度快、对木材分解能力较强的多孔菌科(Polyporaceae)白腐菌,广泛分布于我国东北地区,常见于阔叶林的倒木和枯立木上,能够导致木材发生白色腐朽。为了深入探索偏肿革裥菌降解半纤维素的机理,本研究利用Hi Seq高通量测序技术及LC-MS代谢组检测技术,用两种重要的半纤维素成分即木聚糖和甘露聚糖分别偏肿革裥菌,并选取3个时间点的菌丝进行转录组测序,并对菌丝培养液进行非靶代谢组检测。通过单一组学数据和多组学联合分析,挖掘出偏肿革裥菌降解半纤维素的关键通路及关键基因,探索其分子功能及作用机制,为深入揭示偏肿革裥菌降解半纤维素的机理奠定了重要的分子基础。本文的主要研究结果如下:(1)不同木质基质处理下两种半纤维素酶的酶活测定用木屑和两种重要的半纤维素成分木聚糖和甘露聚糖,分别对偏肿革裥菌进行培养处理,在25 d时间内定期检测其产生的木聚糖酶和甘露聚糖酶的活性变化。结果表明偏肿革裥菌在木屑和单一半纤维素基质条件下,均能产生相应的半纤维素酶,且酶的活性较对照组均明显提高,木聚糖酶和甘露聚糖酶的活性峰值均出现在最后一个时间点第25d,这一时间点也被用于后续组学研究中时间点的选择。(2)木聚糖处理下偏肿革裥菌转录组学分析对木聚糖处理下的偏肿革裥菌进行培养,并选择0 d(CK),13 d(MA)和25 d(MB)这3个时间点的菌丝用于转录组测序。转录组测序结果共得到12,826个基因,其中发掘出新基因788个,进一步丰富了原物种的基因组。CK vs MA组共筛选出706个差异基因,CK vs MB组共筛选出1,047个差异基因,MA vs MB组共筛选出549个差异基因。通过GO功能注释分析可知,差异基因主要归属于单有机体过程、代谢过程及催化活性。通过KEGG富集分析可知,碳代谢(ko01200)、糖胺聚糖降解(ko00531)、其他聚糖降解(ko00511)等通路显著富集。筛选出366个持续上调的差异基因,通过GO富集和KEGG富集分析,共找到12个偏肿革裥菌降解半纤维素的关键通路,并从中筛选出8个与半纤维素降解相关的关键基因,对其进行了RT-q PCR表达量分析。(3)木聚糖处理下偏肿革裥菌代谢组学分析利用液相色谱串联质谱(LC-MS)技术对木聚糖处理0 d、13 d和25 d的偏肿革裥菌培养液进行非靶代谢组学分析。通过主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),在正离子模式下共鉴定出1,223种代谢物,在负离子模式下共鉴定出626种代谢物。通过差异代谢物KEGG富集分析,3个比较组分别富集到53、76和64个代谢通路,在此基础上,设定P value≤0.05,筛选出CK vs MA组中6个显著富集通路,CK vs MB组中13个显著富集通路,MA vs MB组中7个显著富集通路。通过多组学联合分析,找到了木聚糖处理下转录组中12个关键通路中的代谢产物,并构建了关键基因与代谢产物之间的共表达网络。(4)甘露聚糖处理下偏肿革裥菌转录组学分析对偏肿革裥菌在甘露聚糖处理0 d(CK)、13 d(GA)和25 d(GB)的菌丝样品进行转录组测序。在CK vs GA组共筛选出667个差异基因,CK vs GB组共筛选出1,378个差异基因,GA vs GB组共筛选出658个差异基因。通过GO功能注释分析可知,差异基因主要参与代谢过程、细胞过程及催化活性等。通过KEGG富集分析可知,碳代谢(ko01200)、糖胺聚糖降解(ko00531)、其他聚糖降解(ko00511)、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化(ko00040)等通路显著富集。通过差异基因趋势分析,找到498个持续上调的基因进行GO富集和KEGG富集分析,共找到8个偏肿革裥菌降解半纤维素的关键通路并从中筛选出与半纤维素降解相关的11个关键基因,对其表达量进行了RT-q PCR验证。(5)甘露聚糖处理下偏肿革裥菌代谢组学分析对甘露聚糖处理0 d、13 d和25 d下的偏肿革裥菌培养液进行非靶代谢组学分析。对代谢组中的差异代谢物进行研究,在正离子模式下找到了3个比较组中的差异代谢物,分别为58、36和37个;负离子模式下找到了3个比较组中的差异代谢物,分别为13、10和13个。通过差异代谢物KEGG富集分析,3个比较组分别富集到62、70和65个富集通路,并在此基础上,设定P value≤0.05,筛选出CK vs GA组中16个显著富集通路,CK vs GB组中12个显著富集通路,GA vs GB组中7个显著富集通路。通过多组学联合分析,对甘露聚糖处理下转录组中11个关键基因与所在通路的代谢产物进行了共表达网络分析。(6)Lg-M9878基因的鉴定与功能分析Lg-M9878基因的产物为内切1,4-β甘露聚糖酶(endo-1,4-β-mannanase,EC 3.2.1.78),是一种重要的半纤维素降解酶。对Lg-M9878基因进行克隆和生物信息学分析。Lg-M9878基因长度为1,392 bp,编码463个氨基酸,分子质量为49.26 KDa,分子式为C2,198H3,324N582O688S11,为亲水性蛋白,并预测了其二、三级结构等。克隆出Lg-M9878基因的CDS序列,构建了原核表达载体p ET-32a-M9878,并转化到BL21(DE3)大肠杆菌中,使用IPTG成功诱导了p ET-32a-M9878蛋白的表达。利用分子对接,确认了甘露聚糖与Lg-M9878蛋白结合的位置。通过单酶切和连接转化,构建过表达载体p CAMBIA1301-gpd-M9878,并转化到农杆菌LBA4404中。利用根癌农杆菌介导法对偏肿革裥菌进行转染,获得2株过表达Lg-M9878转基因菌株Lg M1和Lg M2。对转基因菌株进行生长型鉴定,并对木屑和甘露聚糖处理下的过表达转基因菌株进行RT-q PCR验证。结果显示过表达菌株的Lg-M9878基因相对表达量持续上调,且甘露聚糖处理下的相对表达量高于木屑处理;通过酶活检测表明转基因菌株Lg M1和Lg M2产生甘露聚糖酶的能力明显高于野生型菌株,Lg-M9878基因的过表达提高了偏肿革裥菌降解半纤维素的能力。综上所述,本研究通过半纤维素酶活性检测,明确了偏肿革裥菌对半纤维素具有降解作用。并通过对木聚糖和甘露聚糖处理下的偏肿革裥菌进行转录组和代谢组学分析,找到了与降解半纤维素相关的代谢通路及关键基因。对一个重要的半纤维素降解酶基因L g-M9878进行了功能验证,表明甘露聚糖可以诱导Lg-M9878基因的表达,过表达的Lg-M9878基因使偏肿革裥菌产生更多的甘露聚糖酶,从而增强其降解半纤维素的能力。本研究解析了偏肿革裥菌降解半纤维素的部分分子机制,为深入揭示白腐菌降解半纤维素的机理奠定了重要的分子基础。
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