刺梨多糖的提取及其体外降脂活性研究

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刺梨又名山王果,是一种具有地域特色的水果,广泛分布在我国西南山区。刺梨营养丰富,富含蛋白质、维生素、无机盐和各种必需氨基酸,还有多糖、酚类化合物、三萜、有机酸和超氧化物歧化酶(SOD)等多种活性成分。刺梨作为一种药食同源植物,在传统医学上用于消食止泻、养阴补虚健脾、祛风除湿、增强免疫力和促进发育,对坏血病、夜盲症、癌症和三高均有一定的预防和治疗功效。多糖是刺梨果实中重要的活性成分之一,但目前关于刺梨多糖的高效提取、降血脂活性及作用机制仍不清楚。本论文首先选择不同提取方法从刺梨果实中提取刺梨多糖,研究了不同提取方法对刺梨多糖理化性质、结构特征和体外活性的影响,初步筛选出活性较优的刺梨多糖;其次,通过脂肪酸诱导人肝癌细胞HepG2建立高脂和损伤模型,探究了刺梨多糖的降脂毒活性、降脂活性及分子机制;最后,通过体外模拟消化模型,探究了刺梨多糖的消化特征、生物利用率以及对油脂消化的影响。本论文制备的刺梨多糖具有较好的抗氧化活性、抑制α-葡萄糖苷酶活性、降脂活性,可制备成药剂、冲剂、益生元含片等应用到相关保健食品或医药中。主要研究结果如下:(1)采用碱提、酸提、酶辅助提取方法从刺梨果实中提取得到三种刺梨多糖,依次命名为Al-RTFP、Ac-RTFP和En-RTFP。研究结果表明三种提取方法显著影响刺梨多糖的提取率、中性糖含量、蛋白质含量和糖醛酸含量。结构分析表明三种刺梨多糖组分均一,相对分子量分别为41 kDa、43.8 kDa和62.9 kDa,主要由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、木糖等组成,其中半乳糖和阿拉伯糖的摩尔百分比含量占比60%以上。三种多糖微观结构呈现疏松多孔的网状海绵结构,在溶液中具有稳定的三螺旋结构。此外,体外活性研究结果表明Al-RTFP具有最强的抗氧化活性、吸附胆固醇和胆酸盐能力,而En-RTFP具有最强的α-葡萄糖苷酶的抑制活性。(2)以油酸诱导HepG2细胞建立高脂模型,评价了三种刺梨多糖的降脂活性。油红O染色结果表明随着三种多糖浓度的提高,高脂HepG2细胞中的脂滴数量和密集程度均有降低,且Al-RTFP组降脂效果最为明显。此外,三种多糖均降低了高脂HepG2细胞的胆固醇和甘油三酯含量,其中Al-RTFP的降脂活性最佳。经过不同浓度的Al-RTFP孵育24 h后,高脂HepG2细胞的胆固醇含量下降了29.82~41.28%,甘油三酯含量下降了14.13~46.18%。分子机制研究结果表明Al-RTFP从以下两个途径减少HepG2脂质积累:(一)Al-RTFP可上调高脂HepG2细胞的腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)蛋白及其磷酸化蛋白(p-AMPK)的表达,从而抑制乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)表达,减少脂肪酸和胆固醇的合成。此外,ACC表达量的降低也减轻了对碱棕榈酰转移酶1(CPT1)的抑制,促进了脂肪酸在细胞线粒体内的β氧化;(二)较高浓度的Al-RTFP上调了沉默调节因子SIRT1蛋白的表达,并由SIRT1进一步促进过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARα)的表达,促进脂肪酸β-氧化。此外,Al-RTFP还降低了棕榈酸PA诱导HepG2产生的脂毒性,降低活性氧(ROS)在HepG2细胞的积累,提高HepG2细胞受损后的线粒体膜电位,具有潜在的预防和治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)的能力。(3)体外消化结果表明,Al-RTFP在模拟口腔、胃、肠道消化过程中,其分子量从41.01 kDa降解到38.09 kDa,还原糖含量从0.39 mg/mL上升到0.58 mg/mL,表明Al-RTFP在消化过程发生的降解主要在碳链末端,而碳链主链没有发生强烈的降解。同时,Al-RTFP可以促进水包油(O/W)乳液在模拟消化过程中的消化稳定性,降低O/W乳液在肠道消化过程中被胰脂肪酶分解速率,并使脂肪酸释放量减少27%,表明Al-RTFP可作为一种食品功能成分促进肠道胆酸循环,减少油脂和胆固醇吸收。此外,体外酵解结果表明Al-RTFP发酵速率慢于低聚果糖,肠道菌群对其生物利用率为74.10%,在发酵过程中0~24 h过程中,总糖和还原糖含量不断降低,酵解液pH从6.58下降到4.83,具有潜在的益生活性。
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