ZNF580是由本课题组克隆的一种新的人C2H2型锌指蛋白基因,与Krüppel样锌指转录因子(Krüppel-like factors,Klfs)家族成员类似,具有参与血管的形成和细胞内信号的转导等功能。而eNOS(内皮型一氧化氮合酶)是维持内皮细胞正常功能所必需的,对于血管的舒张具有很重要的意义。本实验旨在探讨ZNF580在TGF-β诱导内皮细胞表达eNOS中的作用机制。　　 目的:　　 以人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926)为体外模型,在转化生长因子TGF-β的作用下,研究人C2H2型锌脂蛋白新基因ZNF580表达情况,分析ZNF580基因表达与内皮细胞稳态相关因子eNOS之间的关系,以及ZNF580基因过表达和低表达对eNOS表达的影响,进一步揭示ZNF580在TGF-β诱导内皮细胞表达eNOS以及维持内皮细胞稳态中的作用。　　 方法:　　 ①人脐静脉内皮细胞株(EA.hy926),用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基,在37℃、5％CO2、饱和湿度下培养至EA.hy926细胞生长成单层后备用。　　 ②利用Lenti-GFP-ZNF580和Lenti-RNAi-ZNF580瞬时转染EA.hy926内皮细胞,获得瞬时过表达和低表达ZNF580的EA.hy926细胞。运用倒置荧光显微镜观察转染效率,定量PCR以及western-blot鉴定转染后ZNF580和eNOS的表达情况。pGL3-control,pGL3-eNOS-Luc和β-gal质粒共转染EA.hy926细胞,单荧光素酶报告试验检测eNOS和ZNF580的变化趋势是否一致。　　 ③胰酶消化收集对数生长期EA.hy926细胞,将其悬浮于高糖DMEM细胞培养液中,浓度约为5-6×106/ml,接种到六孔板中(2 ml/孔),37℃,5％CO2孵箱培养。在各孔内加TGF-β0ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml,每组设三个平行孔。TGF-β是一个细胞转化生长因子,而eNOS(内皮型一氧化氮合酶)是反映细胞稳态的重要指标。为确定TGF-β对内皮细胞功能的作用情况,不同浓度TGF-β(0-8ng/ml)作用于EA.hy926细胞6h后,收集细胞,提取总RNA和蛋白,利用ReaTime PCR、Western blot方法检测不同浓度TGF-β对ZNF580和eNOS表达的影响。　　 ④在各孔中加入浓度为2ng/ml的TGF-β,每组设三个平行孔,于0h、2h、6h、12h后收集细胞,提取总RNA和蛋白,同样利用ReaTime PCR、Western blot方法检测TGF-β作用不同时间后,ZNF580和eNOS的表达情况。　　 ⑤内皮细胞传代后,实验分为TGF-β处理组、SB431542处理组和DMSO对照组,抽提RNA以及蛋白,采用Realtime PCR、Western blot检测分析TGF-β对内皮细胞内ZNF580和eNOS表达的影响,并分析ZNF580是否通过TGF-β信号通路影响内皮细胞的功能。　　 ⑥内皮细胞传代后,实验分为对照组、TGF-β作用30min组和TGF-β作用120min组,免疫荧光双染后,观察并分析细胞核内Smad2的分布情况和ZNF580的表达情况。　　 ⑦内皮细胞分为6组,EA.hy926、TGF-β组、TGF-β+SB431542组、TGF-β+ Lenti-GFP-ZNF580组、TGF-β+ Lenti-RNAi-ZNF580组和TGF-β+ Lenti-GFP组,通过细胞迁移和细胞增殖实验,分析ZNF580及TGF-β在内皮细胞迁移和增殖中的作用。　　 结果:　　 1、EA.hy926细胞经慢病毒Lenti-GFP-ZNF580、Lenti-RNAi-ZNF580瞬转后,ReaTime PCR、Western blot及荧光素酶报告试验测定结果显示,ZNF580过表达后,细胞内eNOS的表达升高,反之,经RNA干扰ZNF580表达降低后,eNOS的表达也随之降低。　　 2、不同浓度TGF-β作用EA.hy926内皮细胞6h后,提取RNA和蛋白,经定量PCR以及western-blot检测ZNF580和eNOS的变化趋势。结果证实,ZNF580和eNOS在mRNA转录水平和蛋白水平的表达均呈先下降后上升的趋势(P＜0.05)。当TGF-β为2ng/ml时,ZNF580和eNOS表达最低。　　 3、2ng/ml TGF-β作用EA.hy926内皮细胞不同时间后,经定量PCR和western-blot检测,得出ZNF580和eNOS mRNA和蛋白水平的表达均呈现先下降后上升的趋势(P＜0.05)。当TGF-β作用时间为6h时,ZNF580和eNOS的表达最低。　　 4、TGF-β受体特异性阻断剂SB431542作用EA.hy926细胞后,ZNF580和eNOS在mRNA和蛋白水平表达上调。而对照组和DMSO组则没有明显变化。　　 5、TGF-β作用EA.hy926细胞30min和120min后,细胞内Smad2核转位增强,且ZNF580的表达有所减弱。而对照组细胞核内Smad2和ZNF580没有明显变化。　　 6、细胞迁移和细胞增殖实验结果表明,ZNF580过表达使TGF-β对EA.hy926细胞迁移和增殖的抑制作用减弱,而ZNF580低表达使TGF-β对细胞的迁移和增殖的抑制作用增强,与正常组比较,结果均有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论:　　 TGF-β可使Smad2核转位增强,ZNF580的表达减弱。2ng/mlTGF-β作用6h后,ZNF580和eNOS的表达最低。而SB431542可阻断TGF-β对ZNF580和eNOS的调节。ZNF580的过表达(低表达)使其下游靶基因eNOS的表达上调(下调)且使TGF-β对EA.hy926细胞迁移和增殖的抑制作用减弱(增强)。该研究阐明了ZNF580在TGF-β诱导内皮细胞表达eNOS中的作用机制,为探讨人C2H2型锌脂蛋白新基因ZNF580与内皮细胞稳态之间的关系提供了新的科学依据。