随着年龄的增加,骨骼肌的质量和机能都会出现衰退,而在体和离体实验均表明衰老能导致机体的骨骼肌葡萄糖转运水平降低和胰岛素抵抗增加。胰岛素抵抗是多种年龄相关性疾病(如II型糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等)的独立危险因子。骨骼肌的质量约为机体重量的40%,是机体摄取和利用葡萄糖最主要的组织,85%的葡萄糖在骨骼中被摄取和利用,骨骼肌胰岛素信号功能紊乱也是机体发生胰岛素抵抗的主要诱因。因此,增加老年个体骨骼肌内葡萄糖转运和胰岛素敏感性是预防衰老相关性疾病的重要措施。热量限制(Calorie restriction,CR;即热量摄入为自由进食的60-80%)或者急性运动干预均可增加成年大鼠胰岛素诱导的骨骼肌葡萄糖转运及胰岛素敏感性。然而有关急性运动和热量限制对老年大鼠骨骼肌内胰岛素信号通路及葡萄糖转运水平作用的研究较少,热量限制与急性运动对骨骼肌胰岛素信号通路及葡萄糖转运水平的联合干预作用及其机制的研究还未见报道。目的:首先,本研究以不同类型骨骼肌为切入点,深入探究热量限制与急性运动对老年大鼠快肌和慢肌葡萄糖转运的独立及联合干预作用及机制,拟解决:1)急性运动与热量限制独立及联合干预方式对老年大鼠骨骼肌(快肌和慢肌)葡萄糖转运的调节作用;2)以胰岛素信号通路为靶点,研究这些干预措对快肌和慢肌葡萄糖转运的作用机制:不同类型骨骼肌内胰岛信号通路的应答反应。其次,本研究于大鼠老年阶段进行热量限制干预,结合高选择性细胞信号抑制剂,拟解决:1)老年阶段进行热量限制对骨骼肌葡萄糖转运的作用;2)分析其作用机制,研究Akt及Akt2的活化在热量限制增加骨骼肌葡萄糖转运中的调控作用以及潜在参与葡萄转运调控的Akt相关底物。方法:1.急性运动/热量限制对老年大鼠快肌和慢肌葡萄糖转运的独立及联合干预作用及机制(研究一与研究二)以30月龄Fischer 344 x Brown Norway(FBN)清洁级雄性大鼠为研究对象,进行急性运动和热量限制(始于3月龄)独立或联合干预。实验动物随机分为自由进食安静组(AL-SED,n=8)、热量限制安静组(CR-SED,n=8)、自由进食运动组(AL-3h PEX,n=10)、热量限制运动组(CR-3h PEX,n=11)。大鼠的热量限制干预始于第14周(约三月龄)直至30月龄。运动方案:单次间歇性游泳运动,每次游泳时间为10min,间歇时间为10min,共9次。水温维持在35o C左右,总运动时间为90min。所有实验动物在最终实验开始前禁食至少12小时。安静组和运动组大鼠游泳运动结束3小时后,麻醉处死,取其左右两侧肱骨内上髁肌和比目鱼肌。在基础状态(Basal)和生理浓度胰岛素条件(Insulin)下,对离体的肱骨内上髁肌和比目鱼肌进行孵育,骨骼肌孵育结束后,骨骼肌样本分为8组:AL-SED-Basal、AL-SED-Insulin、CR-SED-Basal、CR-SED-Insulin、AL-3h PEX-Basal、AL-3h PEX-Insulin、CR-3h PEX-Basal、CR-3h PEX-Insulin,n=8-11。检测在基础状态和胰岛素刺激下肱骨内上髁肌和比目鱼肌的葡萄糖转运水平及胰岛素信号通路蛋白。具体检测指标如下:1)热量限制干预后大鼠体重的变化;2)3H和14C同位素双标法检测骨骼肌葡萄糖转运速率;3)32P同位素标记法检测IRS-1/PI3K的酶活性;4)用western blot法检测与葡萄糖转运相关的胰岛素信号通路关键蛋白的表达及活化:IR、Akt、AS160、TBC1D1及其磷酸化水平(p IR Try1146、p Akt Ser473、p Akt Thr308、p AS160 Ser588、p AS160 Thr642、p TBC1D1 Thr596);AMPK、ACC、FLNc的蛋白表达及其磷酸化水平(p AMPK Thr172、p ACC Ser79、p FLNc Ser2213);GLUT4、GLUT1、HKII的蛋白表达水平。5)用免疫共沉淀方法检测HSP90、PP2A、APPL1与Akt结合的变化;2.Akt与Akt2在热量限制增加老年大鼠骨骼肌葡萄糖转运中的调控作用(研究三)清洁级雄性FBN大鼠40只,约23月龄,随机分为自由进食组(AL,n=8)和热量限制组(CR,n=8)。经过8周的热量限制干预后,大鼠麻醉处死,取其左右两侧的肱骨内上髁肌。以不同的溶液孵育骨骼肌,在基础状态(Basal)、生理浓度胰岛素(Insulin)及Akt抑制剂(MK2206)条件下,对肱骨内上髁肌进行孵育,骨骼肌孵育结束,骨骼肌样本分为5组:AL-Basal、AL-Insulin、CR-Basal、CR-Insulin、CR-Insulin+MK2206,n=8。对不同条件下骨骼肌样本进行以下指标的检测:1)热量限制干预后大鼠体重的变化;2)3H和14C同位素双标法检测骨骼肌葡萄糖转运速率;3)用32P同位素标记法检测Akt2活性;4)免疫沉淀法检测Akt2 Ser474和Akt2 Thr309磷酸化水平;5)western blot法检测Akt、AS160、TBC1D1、FLNc、PRAS40、AMPK蛋白表达水平及其磷酸化水平(Akt Ser473、Akt Thr308、p AS160 Ser588、p AS160 Thr642、p TBC1D1Thr596、p FLNc Ser2213、p PRAS40 Thr246、p AMPK Thr172)。结果:1.以30月龄FBN大鼠为研究对象,进行急性运动和热量限制(始于3月龄)独立或联合干预,研究结果为:1)与自由进食组大鼠相比,热量限制干预后大鼠体重显著下降。2)热量限制限制显著增加了老年大鼠快肌和慢肌胰岛素诱导的葡萄糖转运水平(P<0.001);急性运动显著增加老年大鼠快肌胰岛素诱导的葡萄糖转运水平(P<0.05),且热量限制与急性运动联合干预导致其水平在此基础上进一步增加(P<0.001);然而,急性运动、热量限制与急性运动联合干预对慢肌葡萄糖转运水平无显著影响。3)热量限制、急性运动、热量限制与急性运动联合干预对老年大鼠快肌和慢肌中近端胰岛素信号通路IR的磷酸化及IRS-PI3K的活性均无显著影响。4)热量限制能显著增加快肌中胰岛素诱导Akt Ser473(P<0.01)、Akt Thr308(P<0.001)、AS160 Ser588(P<0.05)、AS160 Thr642(P<0.05)、FLNc Ser2213(P<0.05)、AMPK Thr172(P<0.01)的磷酸化水平;而对TBC1D1Thr596、ACC Ser79的磷酸化无显著影响;热量限制导致慢肌胰岛素诱导Akt Ser473(P<0.05)、Akt Thr308(P<0.05)、AS160 Ser588(P<0.01)、TBC1D1 Thr596(P<0.001)磷酸化水平显著上升,但对AS160 Thr642、FLNc Ser2213、AMPK Thr172、ACC Ser79磷酸化水平无显著影响。5)急性运动能显著增加快肌胰岛素诱导Akt Ser473(P<0.05)、Akt Thr308(P<0.05)、FLNc Ser2213(P<0.05)的磷酸化水平,但对AS160 Ser588、AS160Thr642、TBC1D1Thr596、ACC Ser79、AMPK Thr172的磷酸化无显著影响;急性运动对慢肌胰岛素诱导的Akt Ser473、Akt Thr308、AS160 Ser588、AS160 Thr642、TBC1D1 Thr596、ACC Ser79、AMPK Thr172、FLNc Ser2213磷酸化水平均无显著影响。6)急性运动与热量限制联合干预能导致快肌中胰岛素诱导Akt Ser473(P<0.01)、Akt Thr308(P<0.001)、FLNc Ser2213(P<0.05)的磷酸化水平显著增加,但对AS160 Ser588、AS160 Thr642、TBC1D1 Thr596、ACC Ser79、AMPK Thr172的磷酸化无显著影响;急性运动与热量限制联合干预能显著增加慢肌胰岛素诱导的AMPK Thr172磷酸化水平(P<0.05),但对Akt Ser473、Akt Thr308、AS160 Ser588、AS160 Thr642、TBC1D1 Thr596、ACC Ser79、FLNc Ser22133磷酸化水平均无显著影响。7)热量限制能增加快肌中HSP90与Akt的结合(P<0.05);PP2A与Akt的结合则在急性运动后显著减少(P<0.05);但急性运动与热量限制联合干预对快肌HSP90、PP2A、Appl与Akt的结合无显著影响;急性运动、热量限制、急性运动与热量限制对慢肌HSP90、PP2A、Appl与Akt的结合均无显著影响。8)热量限制、急性运动、热量限制与急性运动联合干预对快肌和慢肌中Akt、AS160、TBC1D1、FLNc等大多数蛋白无显著影响。9)热量限制能显著减少快肌HKII的蛋白表达(P<0.01),GLUT4的蛋白表达在急性运动后小幅度增加(P<0.01)。热量限制、急性运动对慢肌中HKII、GLTU4的蛋白表达无显著影响。2.以23月龄FBN大鼠为研究对象,在其老年阶段进行热量限制干预,结合Akt抑制剂(MK2206),研究结果为:与自由进食组相比,热量限组大鼠表现为:1)体重显著下降(P<0.05);2)胰岛素诱导骨骼肌葡萄糖转运水平显著增加(P<0.05);3)胰岛素诱导的Akt2活化程度显著上升,包括Akt2两个位点的磷酸化化水平(P<0.001)与Akt2活性的显著增加(P<0.01);4)Akt Thr308与Ser473两个位点磷酸化水平显著增加(P<0.001);5)Akt底物AS160Thr642(P<0.01)、FLNc Ser2213(P<0.01)、PRAS40 Thr246(P<0.001)磷酸化水平显著增加,但TBC1D1 Thr596的磷酸化水平无显著变。6)Akt抑制剂(MK2206)导致了以上这些热量限制的加强效应消失。结论:1.老年大鼠不同类型骨骼肌对热量限制的应答效应有高度一致性,均表现为热量限制能显著增加胰岛素诱导的葡萄糖转运水平,这说明热量限制是增加老年大鼠骨骼肌胰岛素敏感性的有效手段。2.热量限制对老年大鼠快肌和慢肌葡萄糖转运正向调节作用的机制有交汇但又存在差异,热量限制对快肌和慢肌Akt两个位点(Thr308与Ser473)的磷酸化均有增加效应,而快肌中Akt的磷酸化导致AS160丝氨酸(Ser588)和苏氨酸位点(Thr642)磷酸化增加,慢肌中Akt的磷酸化则更多作用于TBC1D1的磷酸化;快肌和慢肌中IR的活化、IRS-1/PI3K的活性、Akt与HSP90、PP2A、APPL1的结合这些因素在这一过程中并未参与调控Akt的磷酸化。胰岛素信号的关键蛋白如IR、Akt、AS160、TBC1D1等的表达水平也并非是热量限制这一调节作用的原因。3.老年大鼠快肌和慢肌葡萄糖转运对急性运动的应答反应不同。快肌的葡萄糖转运和胰岛素敏感性在急性运动后显著增加,其机制可能与Akt Thr308与Ser473两个位点及Akt底物FLNc的磷酸化增加、Akt与PP2A结合减少这些因素相关。而急性运动对慢肌的胰岛素敏感性无增加效应,Akt、AS160、TBC1D1、FLNc等众多蛋白的磷酸化水平也未显著变化。快肌和慢肌中的不同结果可能与肌纤维类型和运动中被募集的肌纤维不同相关。4.热量限制与急性运动联合干预对老年大鼠快肌和慢肌葡萄糖转运的作用不同。快肌中葡萄糖转运水平在热量限制与急性运动联合干预后进一步增加,Akt、FLNc及AMPK的磷酸化水平变化与其一致,其他关键蛋白AS160、TBC1D1等的活化无显著变化,提示快肌葡萄糖转运增加可能继发于其他的机制(比如GLUT4囊泡运输)。老年大鼠慢肌葡萄糖转运水平和胰岛素信号通路相关的众多信号分子(IR、Akt、AS160、TBC1D1、FLNc等)对急性运动与热量限制的联合干预均无显著应答。热量限制与急性运动联合干预对老年大鼠快肌和慢肌胰岛素敏感性的不同作用可能由于不同类型的肌纤维,因其结构特与代谢特征差异性所致。5.老年大鼠快肌中胰岛素诱导的葡萄糖转运水平升高很可能是继发于Akt磷酸化水平的增加,至少部分继发于此。热量限制能显著增加老年大鼠快肌中AS160的磷酸化水平,这说明AS160的磷酸化可能直接参与调控热量限制对骨骼肌葡萄糖转运的增加效应,但急性运动或急性运动与热量限制联合干预对AS160的磷酸化水平无影响,这提示有可能是Akt的其他底物参与了这一过程。FLNc磷酸化水平与Akt磷酸化水平、胰岛素诱导的葡萄糖摄取水平升高保持一致,说明FLNc有可能是潜在的参与调控骨骼肌葡萄糖转运的蛋白分子。6.老年阶段开始进行热量限制也能正向调节大鼠骨骼肌胰岛素诱导的葡萄糖转运与胰岛素敏感性,Akt、Akt2及其底物AS160、FLNc、PRAS40等磷酸化水平升高是其主要的作用机制,但Akt抑制剂导致这些效应消失,这说明Akt与Akt2的活化在这一过程中可能发挥着必不可少的作用。