一氧化氮(NO)是一种兼有细胞内和细胞间的信使和神经递质作用的气体物质。研究发现，NO对神经系统具有双重作用。生理情况下，少量NO可发挥其神经保护作用，病理情况下，大量的一氧化氮合酶(NOS)尤其是诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达激活乍成过量的NO，对神经元及其组织产生巨大的神经毒性作用。NO结构简单又极不稳定，生物半衰期仅5秒左右，因此其直接测定较为困难。体内NO主要在NOS专一催化下合成，在研究中我们可通过测检NOS的量来间接反映NO的量，从而达到研究NO作用的目的。NOS是体内专一催化合成NO的酶，根据组织或细胞来源将NOS分为三型：神经元型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)、诱导型NOS(iNOS)。生理状况下nNOS和eNOS表达，iNOS不表达，其中以nNOS分布最广泛，主要位于中枢神经元，尤其小脑颗粒细胞层和分子层。中枢神经系统中nNOS催化产生的NO主要调节发育期神经元的突触可塑性、信号分子转导。多数报道认为脑损伤早期nNOS激活并释放过量的NO与神经毒性作用有关，但是亦有报道认为NO/nNOS具有神经保护作用，大鼠局灶性脑缺血再灌注24小时后，位于梗死灶中心区的nNOS阳性神经元的数量越多，梗死灶体积越小。大鼠脑部NOS的分布以小脑最多，尤其nNOS大量分布于颗粒细胞层和分子层。由于小脑颗粒神经元(CGNs)是小脑中数量最多的细胞，体外培养方法成熟，易于在体外培养中获得高纯度(>95％)的神经元细胞。此外，体外培养的发育期的CGNs的基因转染效率高于体内成熟的CGNs的基因转染效率。因此，本课题建立小脑颗粒细胞神经元体外培养，使用反义寡核苷酸(AS-ODN)技术抑制nNOS的水平，并观察nNOS被抑制后小脑颗粒细胞神经元发育和存活的变化，从而明确nNOS在神经元发育和存活中的作用。　　 研究目的:　　 通过反义寡核苷酸技术抑制发育期CGNs中的nNOS，探讨nNOS在发育期小脑颗粒细胞中的作用和地位，了解nNOS在神经元生长中所起的作用，为进一步研究NO/nNOS在神经系统损伤中的作用及机制奠定基础。　　 研究方法:　　 1.原代CGNs培养：　　 将出生后7天的SD乳鼠的小脑分离并获得小脑颗粒细胞，种植于已用多聚赖氨酸包被过夜的培养板上，培养于含10％小牛血清、100μg/ml庆大霉素、25mmol/L氯化钾的细胞完全培养基，培养24小时后加入阿糖胞苷以抑制非神经元的生长。　　 2.nNOS AS-ODN设计合成：　　 设计合成nNOS AS-ODN序列，使用随机序列(R-ODN)作为对照。由Biognostik(GmbH，Goettingen，Germany)公司合成。　　 3.寡核苷酸(ODN)的细胞毒性测定：　　 将不同浓度R-ODN加入培养第7天的小脑颗粒细胞，MTT法检测细胞存活率。　　 4.AS-ODN有效转染浓度和时间测定：　　 分别将终浓度为不产生细胞毒性的最高浓度的nNOS AS-ODN和R-ODN加入培养第7天的CGNs中，使用Western blot检测小脑颗粒细胞中的nNOS蛋白表达，使用相同浓度的异硫氰酸荧光素标记的R-ODN(FITC-R-ODN)在倒置荧光显微镜下观察ODN进入细胞的情况，测定获得ODN最高转染效率的最佳浓度和时间。　　 5.AS-ODN对发育期CGNs的影响：　　 RT-PCR检测nNOS的mRNA水平，Western blot和细胞免疫组化测定nNOS蛋白水平的变化，并从细胞免疫组化的结果分析发育中小脑颗粒细胞nNOS的表达。使用MTT法检测nNOS AS-ODN转染后细胞存活率变化，使用中性红染色和显微镜下观察计算小脑颗粒细胞存活数。　　 6.统计学处理：　　 所有实验数据以均数±标准差表示，统计方法使用单因素方差分析及Bonferroni多重比较检验。数据统计采用社会科学统计软件SPSS11.0完成，检验水准定为α=0.05。　　 结果:　　 1.nNOS在发育期CGNs的表达　　 体外培养成功获得纯化的原代小脑颗粒细胞神经元，使用免疫组化方法在CGNs培养的第7天即可检出nNOS蛋白表达阳性的CGNs，且随着时间的推移逐渐增加，nNOS mRNA的表达出现在CGNs培养的第4天，然后逐渐增加，一直持续到第14天。　　 2.ODN的的细胞毒性作用　　 于体外培养7天后分组进行ODN转染处理及后续实验。终浓度10μmol/L和20μmol/L的R-ODN处理后的小脑颗粒细胞存活率较对照组明显下降，显示10μmol/L及以上浓度的R-ODN产生显著细胞毒性作用。　　 3.AS-ODN最佳转染浓度和转染时间　　 终浓度8μmol/L的R-ODN处理72小时后，FITC-R-ODN测定显示转染效率达到最佳，被荧光标记的培养细胞维持正常的形态和细胞密度。CGNs培养第7天，FITC-R-ODN在2小时首次被发现进入小脑颗粒细胞，摄入的细胞数在4～8小时增加，在24至48小时内，累计超过90％的培养的小脑颗粒细胞摄入了FITC-R-ODN，自72小时始逐渐减少。　　 4.nNOS AS-ODN抑制发育期CGNs的nNOS蛋白表达　　 使用8μmol/L的nNOS AS-ODN处理72小时后，小脑颗粒细胞nNOS的mRNA水平无明显变化，但是蛋白的表达较相同浓度的R-ODN对照组下降了大约59％，较阴性对照的TE缓冲液组下降了60％，R-ODN组与TE缓冲液组CGNs的nNOS蛋白表达无显著性差异。　　 5.nNOS AS-ODN降低发育期小脑颗粒细胞的存活率　　 MTT法检测细胞存活率发现，nNOS AS-ODN转染后小脑颗粒细胞存活率较对照组显著降低。中性红染色计数结果亦显示，nNOS AS-ODN转染后存活的小脑颗粒细胞计数较对照组明显减少，结果有显著性差异。　　 结论:　　 1.体外成功培养了原代发育期小脑颗粒细胞。　　 2.nNOS蛋白在小脑颗粒细胞培养的第7～14天表达并随时间延长而增加。　　 3.nNOS mRNA在小脑颗粒细胞培养的第4～14天表达并随时间延长而增加。　　 4.使用nNOS AS-ODN可靶向性下调体外培养的发育期(第7～14天)的小脑颗粒细胞中nNOS的蛋白水平，但不影响同时期小脑颗粒细胞中nNOS mRNA的表达量。　　 5.下调nNOS蛋白可抑制体外培养的发育期的小脑颗粒细胞的活性，降低小脑颗粒细胞的存活率，nNOS对成熟期的小脑颗粒细胞的存活具有促进作用。